Biologická charakterizace nových inhibitorů STK16 – Bc. Adéla FRÜHAUFOVÁ

Anotace:

Zvýšená exprese nebo aktivace kinasy STK16 (Serine/threonine kinase 16) je spojována s agresivnějším fenotypem a nepříznivou prognózou řady nádorových onemocnění. Molekulární mechanismy, kterými se tato kinasa podílí na patologických procesech, však dosud nejsou zcela objasněny. Nové, účinné a selektivní inhibitory kinasy STK16 by tedy mohly představovat nejen cenný nástroj pro výzkum biologických funkcí STK16, ale mohly by mít i klinické využití. V této práci byla optimalizována exprese a purifikace rekombinantní lidské kinasy STK16 značené histidinovým tagem v expresních systémech Escherichia coli a testována účinnost 16 nových inhibitorů STK16. Rekombinantní STK16 byla vypurifikována ve vysoké čistotě a výtěžku. Pomocí metody nano diferenční skenovací fluorimetrie byla pozorována teplotní stabilizace purifikovaného proteinu v přítomnosti 4 nových inhibitorů STK16 reprezentujících hlavní strukturní motivy knihovny. Kinasové in vitro inhibiční testy s rekombinantní STK16 prokázaly schopnost všech 16 testovaných sloučenin inhibovat její kinasovou aktivitu již v nízkých nanomolárních koncentracích. Na základě selektivity stanovené společností Eurofins Discovery a cytometrické analýzy vlivu studovaných sloučenin na buněčný cyklus nádorové buněčné linie MDA-MB-231 byl identifikován vysoce účinný a selektivní inhibitor 8237. Jeho účinky byly srovnatelné s jediným komerčně dostupným inhibitorem STK16, STK16-IN-1, a to na úrovni buněčné signalizace i synergického působení s inhibitory Janushovy kinasy 2. …víceméně

Abstract:

Increased expression or activation of STK16 kinase (Serine/threonine kinase 16) is associated with a more aggressive phenotype and a poor prognosis in a range of cancers. However, the molecular mechanisms by which this kinase contributes to pathological processes have not yet been fully elucidated. Therefore, novel, potent, and selective STK16 kinase inhibitors could provide valuable tools for researching its biological functions, as well as offer potential clinical applications. In this study, the expression and purification of a histidine-tagged recombinant human STK16 kinase were optimized in Escherichia coli expression systems and the potency of 16 novel STK16 inhibitors was evaluated. Recombinant STK16 was purified with high purity and yield. Using nano differential scanning fluorimetry, thermal stabilization of the purified protein was observed in the presence of four new STK16 inhibitors representing the main structural motifs of the library. In vitro kinase inhibition assays with the recombinant protein demonstrated that all 16 tested compounds effectively inhibited STK16 kinase activity at low nanomolar concentrations. Based on the selectivity profiling determined by Eurofins Discovery and cytometric analysis of the effect of the analyzed compounds on the cell cycle of the MDA­MB-231 cancer cell line, compound 8237 was identified as a highly potent and selective STK16 inhibitor. Its effects were comparable to the only commercially available STK16 inhibitor, STK16-IN-1, both in terms of cellular signaling and synergistic effect with Janus kinase 2 inhibitors. …víceméně