Specifická editace genomu pomocí nukleáz – Petr NICKL

Anotace:

Geneticky podmíněná onemocnění jsou v současné době většinou léčena pouze symptomaticky. Vývoj místně specifických nukleáz, jako je nukleáza zinkového prstu, TALEN či CRISPR/Cas9, může velkým způsobem přispět ke genové terapii dědičných onemocnění na úrovni DNA, kde je využito přirozených procesů opravy genetické informace. Místně specifické nukleázy pronikají do jádra, kde vytváří zlomy DNA v konkrétních sekvencích. Buňka reaguje na tyto zlomy spuštěním reparačního systému, přičemž volí ze dvou způsobů opravy spojování nehomologních konců nebo homologně řízená oprava. Na základě způsobu, kterým buňka DNA opraví, mohou být vkládány delece či inzerce v konkrétních místech genomu, a to za předpokladu, že je porušená DNA opravována způsobem spojování nehomologních konců. Dále může být do konkrétního místa v genomu přepsána sekvence podle přítomného templátu prostřednictvím homologně řízené opravy DNA. Experimentální část této práce byla věnována vypnutí genu RPS19 pomocí CRISPR/Cas9 systému. Jako cílové místo byl v rámci genu zvolen exon 3. Tento úsek byl vybrán z důvodu umístění bodové mutace R56Q, která se vyskytuje u pacientů s Diamond Blackfanovou anémií a jako jedna z mnoha dalších mutací v ribosomálních proteinech se podílí na projevu tohoto onemocnění. Postup zahrnoval analýzu vhodných míst pro editaci v rámci exonu 3 a navržení příslušných DNA oligonukleotidů kódujících sgRNA, které jsou nutné pro navedení proteinu Cas9 na cílovou sekvenci. Následně byl připraven expresní vektor kódující protein Cas9, který dále obsahoval naváděcí informaci pro protein v podobě inzertovaného specifického DNA oligonukleotidu. Nakonec byl tento vektor transfekován do lidských buněk a následné změny v cílových sekvencích byly analyzovány sekvenováním nové generace. …víceméně

Abstract:

Genetically-mediated diseases are recently treated mainly symptomatically. The development of site-specific nucleases, such as zinc finger nuclease, TALEN or CRISPR / Cas9 system, can greatly contribute to the gene therapy of genetic disorders at the DNA level, where natural processes of genetic information repair are used. Site - specific nucleases penetrate the nucleus, where they generate DNA breaks in specific loci. The cell responds to these breaks by activation of a repair system that chooses from two ways of repairing the DNA break - non-homologous ends joining or homology directed repair. Based on the chosen way of repair, deletions or insertions might be created at specific sites of the genome, provided that the broken DNA is corrected by the method of non-homologous ends joining. Additionally, a sequence in a specific site in the genome can be transcribed in accordance with present template via homologous DNA repair. The experimental part of this work was devoted to knock-out the RPS19 gene using the CRISPR/Cas9 system. The target site within the gene was exon 3. This segment was selected due to the occurrence of the R56Q mutation that has been found among the patients with Diamond-Blackfan anemia and as one of many other mutations in genes for ribosomal proteins is involve in the manifestation of this disease. The procedure comprised of analyzing suitable sites for editing within exon 3 and designing the appropriate DNA oligonucleotides encoding sgRNAs. These sgRNAs are essential for directing the Cas9 protein to the target sequence. Subsequently, an expression vector encoding Cas9 protein was prepared. The vector also contained a guiding sequence for the protein in the form of inserted specific DNA oligonucleotide. Eventually, this vector was transfected into human cells and subsequent changes in target sequences were analyzed by the next generation sequencing. …víceméně