Studium enzymů metabolizujících ornitin – Bc. Jan TANCER

Anotace:

Acetylace je enzymaticky katalyzovaná reakce modulující širokou škálu molekulárně-biologických dějů. S acetylací je spojeno značné množství biomakromolekul i nízkomolekulárních sloučenin, jako například aminokyseliny či polyaminy. Tato diplomová práce je zaměřena na expresi rekombinantních enzymů N-acetylaminotransferasy (NATA) a ornitin-delta-aminotransferasy (OAT) z kukuřice seté (Zea mays) a následnou charakterizaci ZmOAT. NATA katalyzuje acetylaci aminoskupiny ornitinu v pozici N2, zatímco OAT katalyzuje transaminaci aminoskupiny v pozici N5, za vzniku glutamát-5-semialdehydu. Oba geny kódující ZmNATA a ZmOAT byly úspěšně klonovány a exprimovány v buňkách E. coli. Byla provedena optimalizace exprese rekombinantních proteinů, které byly následně vypurifikovány. Stabilita enzymu byla měřena pomocí nanodiferenciální skenovací fluorimetrie. U ZmOAT byla studována možnost přeměny N2-acetylornitinu na N2-acetylglutamát-5-semialdehyd. Vznik produktů reakce OAT s ornitinem byl potvrzen spřaženou reakcí s kukuřičnou glutamát-semialdehyddehydrogenasou (aldehyddehydrogenasou12, ZmALDH12). Byla provedena fylogenetická analýza rodiny OAT. S využitím technik molekulárního modelování byla studována možnost vazby acetylovaného substrátu v aktivním místě OAT. …víceméně

Abstract:

Acetylation is an enzymatically catalyzed reaction that modulates a wide range of molecular biological processes. A significant number of biomacromolecules and low molecular weight compounds, such as amino acids and polyamines, are associated with acetylation. This thesis focuses on the expression of the recombinant enzymes N-acetyl aminotransferase (NATA) and ornithine--aminotransferase (OAT) from maize (Zea mays) and the subsequent characterization of ZmOAT. NATA catalyzes the acetylation of the ornithine amino group at the N2 position, whereas OAT catalyzes the transamination of the amino group at the N5 position, to form glutamate-5-semialdehyde. Both genes encoding ZmNATA and ZmOAT were successfully cloned and expressed in E. coli cells. The expression of the recombinant proteins was optimized and they were subsequently purified. The stability of the enzymes was measured by nanodifferential scanning fluorimetry. The possibility of converting N2-acetylornithine to N2-acetylglutamate-5-semialdehyde was studied for ZmOAT. The formation of the OAT reaction products with ornithine was confirmed by coupled reaction with maize glutamate-semialdehyde dehydrogenase (aldehyde dehydrogenase12, ZmALDH12). A phylogenetic analysis of the OAT family was performed. The possibility of acetylated substrate binding in the active site of OAT was studied using molecular modeling techniques. …víceméně