Stanovení proteinových aduktů 4-hydroxyacetanilidu – Bc. Lenka Dosedělová

Anotace:

Lidský organismus během života přijde do styku s mnoha cizorodými látkami. Tyto látky jsou v organismu metabolizovány pomocí I. a II. biotransformační fáze. Paracetamol, běžně užívané antipyretikum a analgetikum, je také xenobiotickou látkou se svoji specifickou biotransformační cestou. Prvním meziproduktem po proběhnutí I. fáze biotransformace je N acetyl-p-benzochinonimin, jenž reaguje pomocí konjugační reakce s glutathionem. V případě požití nadměrného množství paracetamolu představuje tento meziprodukt příčinu vzniku hepatotoxicity, neboť dochází ke vzniku proteinových aduktů paracetamolu. Hlavním cílem naší práce bylo optimalizovat postup přípravy pro stanovení koncentrace proteinových aduktů paracetamolu pomocí LC/MS/MS a jeho následné využití na různých druzích biologického materiálu. Během optimalizace jsme se zaměřili na jednotlivé kroky přípravy vzorku, jako jsou dialýza a proteolýza. Dobu optimálního trvání dialýzy jsme v rámci testování určili na 6 hodin s šesti výměnami dialyzačního pufru, kdy za těchto podmínek byla účinnost dialýzy 93 %. U proteolýzy jsme jako optimální dobu trvání určili inkubaci 4 hodiny, aniž by došlo ke snížení výtěžnosti stanovovaných proteinových aduktů paracetamolu. Stejně tak jsme přítomnost vápenatých iontů neprokázali jako významný faktor pro míru výtěžnosti aduktů paracetamolu. Optimalizované postupy jsme použili při analýze vzorků biologického materiálu (jaterní tkáň myší, kultivované buňky a lidská plazma). Zde jsme se zaměřili na zjištění změny koncentrace proteinových aduktů: 1) v závislosti času a toxické dávky u myší, 2) při vzniku proteinových aduktů paracetamolu v plazmě člověka po podání terapeutické dávky, a 3) u buněk ledvin po jejich inkubaci s paracetamolem. Až na poslední případ jsme námi optimalizovanou metodou byli schopni proteinové adukty nejen detekovat, ale také kvantifikovat. S ohledem na to lze závěrem říci, že jsme zavedli a optimalizovali analytickou metodu pro stanovení proteinových aduktů paracetamolu v biologickém materiálu, která je vhodná pro charakterizaci metabolismu paracetamolu v podmínkách in vivo. …víceméně

Abstract:

The human body encounters vast number of airborne or therapeutic xenobiotic substances during lifetime. These substances are metabolized in two biotransfromation phases (I and II). Paracetamol, commonly used antipyretic and analgesic, is also a xenobiotic substance with unique biotransformation pathway. N-acetyl-p-benzoquinone imine, the intermediate product of phase I, is the cause of hepatotoxicity in cases of acetaminophen overdose. Therefore, it conjugates with glutathione in the cell. The main aim of our work was to optimize process of preparation for the assessment of paracetamol protein adducts by LC/MS/MS technique and subsequently to analyse adduct levels in a variety of materials. Firstly, we focused on preparation of sample procedure, i.e. optimization of dialysis and proteolysis. We determined the optimal time duration of dialysis for 6 hours with six changes of dialysis buffer. The efficacy was 93 % at these conditions. We shortened the time of proteolysis to 4 hours without any decrease in yield of assessed paracetamol protein adducts. In addition, we did not demostrate the effect of calcium ions presence as a factor of influencing the levels of paracetamol adducts. We used optimized processes of sample preparation for the analysis of adducts in biological material (murine liver, cultured cells and human plasma). We focused on determination of changes of protein adducts concentration: 1) in relation to time and paracetamol toxic dose in mice 2) during characterization of paracetamol protein adducts levels in human plasma after admission of therapeutic dose and 3) in kidney cells after incubation with toxic dose of paracetamol. We were able to detect and quantify paracetamol adducts in all experiments expect of cultured cells. We conclude that we introduced and optimized an analytical method for the assessment of paracetamol protein adducts in biological material, which is suitable for the characterization of paracetamol metabolism in vivo. …víceméně