Transformace lnu pro zlepšování užitných vlastností – Ing. Michaela Pavelková

Anotace:

Tato práce je zaměřena na snížení exprese genu fad2 (fatty acid desaturase 2) ve lnu (Linum usitatissimum L.) pomocí metod genového inženýrství. Snížení exprese genu fad2 může vést ke zvýšenému obsahu kyseliny olejové v semenech lnu. K dosažení snížené exprese byly aplikovány dva různé přístupy. První z nich spočíval v umlčení genu pro FAD2 prostřednictvím mechanismu post-transkripčního umlčování (RNA interference). Při tvorbě konstruktu indukujícího RNA interferenci byl fragment genu fad2 vložen v sense/antisense orientaci pod 35S pomotor do vektoru pHannibal. Expresní kazeta byla klonována do vektorového systému pGreenII, který obsahoval reportérový gen pro histochemické GUS testování (uidA) a selekční gen pro rezistenci k fosfinotricinu (bar). Následně byla provedena agrobakteriální transformace segmentů hypokotylů lnu setého. Druhým přístupem pro zvýšení obsahu kyseliny olejové v semenech lnu byla transformace s využitím konstruktů TALENs (Tale nucleases trascription activator-like effectors). Po úspěšné transformaci měla dle předpokladu vzniknout v genu fad2-1 (či fad2-2) mutace, čímž měla být snížena jeho funkčnost, a tudíž i desaturace kyseliny olejové na kyselinu linolovou. Konstrukty byly vytvořeny pro indukci vzniku mutace v genu fad2-1 (konstrukty pVO045, pVO046, pVO047) a pro vznik mutace v genu fad2-2 (konstrukty pVO048 a pVO049). TALENs konstrukt pVO045 spolu s kontrolním konstruktem obsahujícím gen uidA byly použity také pro zkušební transformaci lnu metodou floral dip. …víceméně

Abstract:

This work is focused on downregulation of the fad2 (fatty acid desaturase 2) gene in flax (Linum usitatissimum L.) using the methods of genetic engineering. The downregulation of the fad2 gene should lead to increased oleic acid content in linseed.To achieve the fad2 downregulation, two different approaches were applied. The first approach was based on fad2 RNA mediated post-transcriptional gene silencing. As a part of RNAi construct creation fragments of fad2 gene were inserted in sense/antisense orientation under the 35S promoter in to the pHannibal plasmid. Resulting expression cassette was cloned into pGreen II vector system containing a reporter gene for GUS histochemical testing (uidA) and selection gene for resistance to the herbicide phosphinotricin (bar). Agrobacterium-mediated transformation of flax hypocotyls was performed. The second approach to achieve the increased oleic acid content was the flax transformation using TALENs (Tale nucleases trascription activator-like effectors) constructs. After the successful transformation a mutation in fad2-1 (fad2-2) gene should be induced. As a consequence the function of fad2 gene should be disrupted resulting in lower desaturation of oleic acid to linoleic acid. The constructs were created to induce a mutation in fad2-1 gene (constructs pVO045, pVO046, pVO047) and to induce a mutation in fad2-2 gene (pVO048 and pVO049). TALENs construct pVO045 together with control construct containing uidA gene were used for flax floral dip trial transformation. …víceméně