Stanovení kyseliny jasmonové v biologickém materiálu – Jan Pavlík

Anotace:

Fyziologické procesy v rostlinách jsou regulovány různými mechanismy. Velmi důležitou roli ve vývoji a růstu rostlin hrají fytohormony a látky s regulační aktivitou. Jednou z těchto látek je i kyselina jasmonová (JA). Svou metabolickou činností ovlivňuje klíčení semen, stáčení výhonků, vývoj květů a plodů či stárnutí rostliny. V neposlední řadě má signální funkci při stresu rostlin, což vede k expresi obranných genů. Tato práce porovnává dva extrakční a purifikační postupy pro stanovení kyseliny jasmonové z rostlinného materiálu. Společným extrakčním činidlem těchto postupů je 80% methanol s následným přečištěním pomocí extrakce na tuhou fázi (nepolární reverzní a iontově výměnnou). U prvního postupu je použita klasická extrakce do většího objemu činidla a purifikace na C18/DEAE-Sephadex/Sep-Pak C18. Druhý, nově navržený, postup využívá moderních extrakčních a purifikačních metod - extrakci v mikroměřítku a směsné Oasis MAX kolony. Výsledné vzorky jsou určeny pro analýzu kombinující vysoce účinnou kapalinovou chromatografii s hmotnostní spektrometrií. Rozdílnost obou metod spočívá nejen v poloviční časové náročnosti, ale hlavně v různých návratnostech testovaných postupů, pouze kolem 40% u prvního z nich a přes 90% pro druhý. Na závěr je praktické využití nové metody ukázáno na stanovení závislosti mezi obsahem kyseliny jasmonové v listech rostliny Arabidopsis thaliana a časem, který uplynul po poranění rostliny. K největšímu nárůstu hladiny JA dochází během prvních 30 minut a absolutně nejvyšší množství je stanoveno po šedesáti minutách. Podle naměřených výsledků lze usuzovat, že postup mikroextrakce a purifikace na směsných MAX kolonách pro analýzu kyseliny jasmonové je vhodný nejen pro testovanou A. thaliana, ale i pro studium hladin JA u jiných stresovaných rostlin …víceméně

Abstract:

Physiological processes in plants are regulated by different mechanisms. Plant hormones play important regulatory roles during growth and developmental processes. Jasmonic acid (JA) is one of these substances. Its metabolic activity affects seed germination, tendril coiling, flower and fruit development, senescence and plant defense. Finally, JA plays the signal function in plant stress, leading to expression of defense genes. In this study, two extraction and purification procedures for the determination of jasmonic acid from plant material are compared. The common extraction agent 80% methanol is followed by purification using solid phase non-polar ion exchange and reverse extraction. The first procedure combines more conventional extraction volume of methanolic reagent and purification on C18/DEAE-Sephadex/Sep-Pak C18. In the second, newly designed, the modern extraction process and purification techniques are used - microextraction and mixed Oasis MAX column. The samples are subsequently analyzed by high performance liquid chromatography and mass spectrometry. In summary, the divergence of the both methods is not only in less time-consuming but especially in the various recoveries of tested procedures, close to 40% in the first, and higher than 90% for the second. Finally, the new method is applied on determination of dependence between the content of jasmonic acid in leaves of Arabidopsis thaliana and the time after wounding of plant. The greatest increase in the levels of JA is during the first 30 minutes, and the absolute highest amount is determined sixty minutes after wounding. In conclusion, the measured results suggest that the protocol for analysis of jasmonic acid using microextraction and purification with the mixed-mode MAX columns is suitable not only for the tested A. thaliana, but also for study of JA levels in other stressed plants …víceméně