Využití polárních stacionárních fází pro fytochemickou analýzu – Barbora Dvořáková

Anotace:

Tato diplomová práce se zabývá využitím polárních stacionárních fází k chromatografické separaci vybraných fytochemikálií a jejich metabolitu produkovaného živočišnou buňkou - kyseliny hippurové. Mezi studované polární stacionární fáze patří silikagel, se kterým bylo pracováno v systému normálních fází (bezvodé prostředí) a v systému s hydrofilními interakcemi (HILIC). Dalším studovaným sorbentem v HILIC systému byl modifikovaný silikagel s navázanou karbamoylovou skupinou. Výsledky získané na polárních stacionárních fázích byly porovnány s výsledky na dosud v praxi nejčastěji používaných reverzních fázích. V teoretické části je stručně popsána biosyntéza a funkce fytochemikálií a jejich význam pro lidský organismus, konkrétně fenolických kyselin a polyfenolických látek a produktů jejich biotransformace živočišnou buňkou. Dále jsou v teoretické části popsány používané stacionární fáze a mechanismy, které jsou uplatňovány při retenci látek. V experimentální části je uveden podrobný postup optimalizace separace modelové směsi na jednotlivých typech kolon. Analýza v systému reverzních fází s využitím jednoduchých generických mobilních fází umožnila separaci směsi studovaných látek kromě páru kyselina vanilová-katechin. Velká pozornost byla věnována optimalizaci složení mobilní fáze pro analýzu v systému HILIC. Obě testované HILIC kolony umožnily separaci všech složek modelové směsi. Bylo zjištěno, že u obou HILIC systémů lze optimální separace dosáhnout při použití analogické pufrované mobilní fáze (složka A = acetonitril:acetátový pufr (pH 6) 95:5, složka B = acetonitril:acetátový pufr (pH 6) 80:20) a vhodným profilem gradientu. Stacionární fáze založená na modifikovaném silikagelu s navázanou karbamoylovou skupinou vykazovala oproti nemodifikovanému silikagelu větší retenci fenolických kyselin a proto bylo třeba použít profil gradientu s vyšší eluční silou. Na silikagelu v systému normálních fází (použití bezvodých mobilních fází) nebylo možné, i přes rozsáhlou optimalizaci složení mobilní fáze, dosáhnout separace všech látek směsi na základní linii …víceméně

Abstract:

My diploma thesis is concerned with the usage of polar stationary phases in separation of chosen phytochemicals and their metabolite produced by animal cell - hippuric acid. The studied polar stationary phases comprise unmodified silicagel used in normal phase mode (without water) and in system with hydrophilic interactions (HILIC). Other sorbent used in HILIC system was silicagel with bonded carbamoyl groups. The obtained results on polar stationary phases and on reversed phase (most frequently used) were compared. Theoretical part briefly describes biosynthesis and function of phytochemicals and their importance for human organism. More precisely, I explained the phenolic acids and polyphenolic substances and products of their biotransformation by animal cells. Moreover, the theoretical part describes tested stationary phases and mechanisms, which are used in retention of analytes. The experimental part discusses in detail the optimization process of model mixture separation on each column. Reverse phase analysis with generic mobile phases allows separation of model mixture except for the vanillic acid-catechin pair. Special attention was paid to the optimization of model mixture analysis in HILIC system. Both HILIC columns made a separation all components of model mixture possible. It was revealed that both HILIC systems can achieve the optimal separation with analogous buffered mobile phase (component A = acetonitrile:ammonium acetate (pH 6) 95:5, B = acetonitrile:ammonium acetate (pH 6) 80:20) and suitable gradient profile. Silica-based stationary phase with bonded carbamoyl group provided larger retention of fenolic acids compared to unmodified silicagel. Therefore, a gradient with greater elution strength was applied. In spite of wide optimisation of the mobile phase composition on silicagel used in normal phase mode (without water), was not able to achieve complete separation all components of model mixture …víceméně