Ovlivnění cytotoxicity xenobiotik – Mgr. Zdeněk DOSTÁL

Anotace:

Předkládaná disertační práce se zabývá různými možnostmi ovlivnění cytotoxicity xenobiotik, mezi které patří i protinádorová léčiva. Jejich aplikace v léčebné terapii vyvolává selekční tlak na nádorové buňky, který může končit vznikem rezistence. Proto je důležité zkoumat možnosti, které dovolí tuto rezistenci překonat. Mechanizmů vzniku rezistence existuje mnoho, jedním z nich je aberantní exprese proteinů rodiny Bcl-2, které mají ústřední roli v udržování homeostázy mezi apoptózou a přežíváním. Jiný mechanizmus souvisí s funkcí ABC transportérů. První studovanou možností byla transfekce buněk HeLa prekurzory rodiny miR-29, kdy naše studie odhalila významné navýšení cytotoxicity etoposidu v důsledku transfekce miR-29b. Následně jsme se zaměřili na mechanizmus, pro který je miR-29b v naší studii unikátní. Výsledky experimentů ukázaly důležitost regulace proteinu Mcl-1, který je validovaným cílem rodiny miR-29. miR-29b, na rozdíl od ostatních členů, vyvolala nejen pokles tzv. dlouhé formy Mcl-1L, ale i změnu poměru dlouhé a krátké formy, což ukazuje na zesílení proapoptotické signalizace. Nakonec jsme prokázali spojitost jaderné lokalizace miR-29b s navýšením cytotoxicity etoposidu. Druhým zkoumaným přístupem bylo farmakologické navýšení účinku etoposidu v buněčné linii Hep G2. V rámci tohoto projektu jsme prokázali synergický účinek koinkubace mifepristonu a etoposidu závislý na dávce. Dalším cílem bylo nalezení mechanizmu účinku mifepristonu. Hlavním důvodem synergie je mifepristonem způsobené navýšení intracelulární koncentrace etoposidu díky nespecifické inhibici ABC transportérů. Pozorovaný trend v navýšení exprese proteinu Bax pravděpodobně napomáhá vstupu buněk Hep G2 do apoptózy. Současný výzkum odhaluje schopnost přírodních látek hojně zastoupených v potravě regulovat expresi významných miRNA spojovaných s onkogenezí. V našem případě jsme se zaměřili na ovlivnění expresních profilů buněčné linie Hep G2 a primárních kultur lidských hepatocytů jako modelů jaterní tkáně pomocí kvercetinu a taxifolinu. Zjistili jsme, že fyziologicky dosažitelná koncentrace vybraných polyfenolů moduluje expresní profil miRNA u obou použitých modelů. Jedním z výsledných účinků taxifolinu je navýšení exprese proteinu ZEB2, který je zapojen v epiteliálně-mezenchymální tranzici. Nicméně exprese vimentinu byla oproti očekávání snížena, což naznačuje existenci dalšího vlivu taxifolinu. Předběžné výsledky naznačují možné zapojení taxifolinu do regulace -cateninu, které by vysvětlovalo na první pohled nesourodá data mezi expresí proteinu ZEB2 a vimentinu. Výsledky disertační práce ukazují potenciální směry v modulaci cytotoxicity xenobiotik s cílem zlepšení odezvy modelových nádorových buněčných linií na terapii. …víceméně

Abstract:

The dissertation thesis is focused on possibilities of enhancing cytotoxicity of xenobiotics, including anticancer drugs. Their application during therapies applies selection pressure on tumor cells, which may result in development of resistance. Therefore, it is important to explore the possibilities that will allow the resistance to be overcomed. There are many mechanisms of resistance, one of which is the aberrant expression of Bcl-2 family proteins that play a central role in maintaining homeostasis between cell apoptosis and survival. Another mechanism is related to the function of ABC transporters. The first study focused on transfection of HeLa cells with the miR-29 family precursors. The study revealed an increase in etoposide cytotoxicity only during miR-29b transfection. Subsequently, we focused on the mechanism for which miR-29b is unique in our study. Our results demonstrate the importance of regulation of the Mcl-1 protein, which is recognized as a validated target for miR-29 family. miR-29b, in contrast to other members, induced a decrease of Mcl-1L expression as well as a change in Mcl-1L/Mcl-1S ratio, which means an increase in proapoptotic signalling. Finally, we have shown the association of nuclear localisation of miR-29b with the increased cytotoxicity of etoposide. The second investigated approach was a pharmacological enhancement of the effect of etoposide in Hep G2 cells. In this project, we have demonstrated a synergistic and dose dependent effect of co-incubation of mifepristone and etoposide. Another aim was to find the mechanism of action of mifepristone. The synergy is caused by increase in the intracellular concentration of etoposide due to non-specific inhibition of ABC transporters by mifepristone. The observed trend in Bax protein expression is likely to facilitate entry of Hep G2 cells into apoptosis. Recent research reveals the ability of natural compounds abundant in the diet to regulate expression of significant tumor-related miRNAs. We focused on modulation of expression profiles induced by quercetin and taxifolin in Hep G2 cell line and primary cultures of human hepatocytes as models of liver tissue. We have found that the physiological concentration of both selected polyphenols modulates miRNA expression profiles in both models. We discovered that in Hep G2 cell line taxifolin increased ZEB2 protein, which is involved in epithelial-mesenchymal transition. Surprisingly, vimentin expression was reduced, indicating existence of further regulation by taxifolin. Preliminary results suggest possible involvement of taxifolin in -catenin regulation, that can explain disparate results of ZEB2 and vimentin expression. The results of the dissertation thesis show potential directions in the modulation of xenobiotics cytotoxicity with the aim of improving the response of model tumor cell lines to therapy. …víceméně