Role malých Ran GTPáz v acentrozomálních rostlinných buňkách – Lenka Binarová

Anotace:

Malé GTPázy (GTP vazebné proteiny) regulují v eukaryotických buňkách mnoho procesů, jako např. proliferaci buněk, organizaci cytoskeletu, přenos signálu a další. Jsou to proteiny, fungující jako molekulární přepínače, cyklující mezi GTP aktivním a GDP inaktivním stádiem. Jejich cyklus je tedy spojen s navázáním a hydrolýzou GTP. U živočišných buněk jsou mikrotubuly nukleovány z MTOC (mikrotubuly organizujících center), což je obvykle centrozóm. Rostlinné buňky jsou však acentrozomální a mikrotubuly jsou organizovány z disperzních MTOC. Ran GTPázy jsou důležité pro organizaci mikrotubulů a organizaci mitotického vřeténka a též pro acentrozomální nukleaci mikrotubulů. O jejich roli v tomto procesu u vyšších rostlin, které představují důležitý model acentrozomální nukleace mikrotubulů, se zatím mnoho neví. V rámci diplomové práce byl částečně charakterizován vybraný protein Ran GTPázové dráhy - rostlinný homolog proteinu RanBPM-AtRanBPM z Arabidopsis thaliana. Práce byla prováděna v Laboratoři rostlinného cytoskeletu a buněčného cyklu na Ústavu experimentální botaniky AV ČR v Olomouci v rámci řešení grantových projektů. Prvním krokem práce bylo vyklonování celého genu AtRanBPM a jeho dvou domén LisH a SPRY. Gateway technologií byl gen AtRanBPM a jeho domény překlonovány do expresních vektorů pro GFP fúze. Transientní exprese AtRanBPM proteinu a jeho domén bylo dosaženo metodou particle bombardmentu a metodou transformace rostlin tabáku Agrobacteriem nesoucím příslušné konstrukty. Domény i celý protein AtRanBPM vykazovaly v obou systémech pro transientní expresi difúzní signál přítomný v jádře a cytoplazmě. Dálším krokem byla transformace suspenzí Arabidopsis thaliana konstruktem nesoucím celý gen AtRanBPM. Podařilo se odvodit stabilní kulturu, která exprimovala AtRanBPM protein. Ten byl přítomen v jádře interfázních buněk a také v cytoplazmatických provazcích a v mitotických buňkách v oblasti mitotického vřeténka. Tato lokalizace byla potvrzena i technikou nepřímé imunofluorescence, která rovněž umožnila sledovat kolokalizaci AtRanBPM proteinu s gamma-tubulinem a s mikrotubuly v interfázních i mitotických buňkách. Získané výsledky naznačily možnou roli proteinu AtRanBPM, který náleží k proteinům Ran GTPázové dráhy, v organizaci cytoskeletu v buňkách vyšších rostlin …víceméně

Abstract:

Small GTPases are regulators of numerous processes such as signal transduction, cell proliferation and organization of cytoskeleton in eukaryotic cells. Small GTPases work as molecular switches, which are cycling between active and inactive states. Their function is thus dependent on the periodical association or dissociation of GTP. Microtubules are nucleated from MTOC which is represented by centrosom in animal. Nevertheless, plant cells are acentrosomal lacking discrete site for microtubule nucleation and microtubules are organized from disperse MTOC. Ran GTPases that belong to Ras superfamily are important for organization of microtubules, mitotic spindle as well as for acentrosomal nucleation of microtubules. Although higher plant cell present an important model for acentrosomal microtubules nucleation, role of Ran GTPases in the process remains to be elucidated. The AtRanBPM protein-Arabidopsis thaliana homologue of mammalian RanBPM GTPase was characterized in the frame of this diploma thesis. At first the cloning of AtRanBPM gene and its LisH and SPRY domains was performed using Gateway technology. Subsequently the gene was transferred to the destination vectors for plant expression of GFP fusions. The tobacco cells were transformed with AtRanBPM constructs using two different experimental approaches: particle bombardment or Agrobacterium transfection. Observation of cells with transient expression of entire gene and its LisH and SPRY domains revealed localization similar pattern; GFP proteins were observed both in nucleus and in cytosol. Next, A. thaliana suspension cultures were transformed with AtRanBPM gene. The stable lines expressing AtRanBPM have been established and localization of GFP fusion proteins was analysed in vivo. In interphase we observed a localization of AtRanBPM in nuclei and cytoplasm. GFP-AtRanBPM localized with mitotic spindle in metaphase and anaphase. The localization pattern was confirmed using in-direct immunofluorescence staining, that also enable to analyze co localization of AtRanBPM with gamma-tubulin and microtubules. The data presented here suggested possible role for AtRanBPM protein in microtubular cytoskeleton organization in acentrosomal higher-plant cells …víceméně