Cytokininy v tRNA – Mgr. Štěpán KOUŘIL

Anotace:

Teoretická část diplomové práce je věnována rostlinným hormonům cytokininům, zejména pak jejich analýze. Dále je popsána problematika nukleových kyselin, s důrazem na možnosti jejich sekvenování a transferovou RNA. V rámci experimentální části bylo provedeno stanovení volných cytokininů a cytokininů vázaných v tRNA topolu kanadského (Populus × canadensis Moench cv. Robusta) v průběhu vegetačního období. Podařilo se vyvinout metodu pro purifikaci tRNA obsahující ortho-topolin ribosid pomocí mikro magnetické imunoafinitní extrakce, při které dochází k obohacení tRNA obsahující oTR přesahujícímu 99 % vzhledem k tRNA obsahující cytokininy isoprenoidní. Byly testovány tři typy magnetických částic, ze kterých nejlepší výsledky poskytují chitosanové mikročástice CHIT2 s imobilizovanými monoklonálními polyspecifickými protilátkami 1G6 připravenými proti oTR. Kapacita těchto částic dosahovala 0,90 ? 0,09 pmol tRNA obsahující oTR na miligram mikročástic. Dále byla nalezena směsná matrice kyseliny 3-hydroxypikolinové a kyseliny anthranilové a vhodné podmínky pro sekvenování ssDNA primerů pomocí hmotnostní spektrometrie s MALDI ionizací. Aplikace této sekvenační metody na transferovou RNA ovšem úspěšná nebyla. …víceméně

Abstract:

The theoretical part of this diploma thesis is devoted to plant hormones cytokinins, especially to their analysis. The problematics of nucleic acids is also described, with an emphasis on their sequencing and transfer RNA. In the experimental part, the content of free cytokinins and tRNA-bound cytokinins in Populus × canadensis Moench cv. Robusta leaves during the growing season was determined. We managed to develop a method for the purification of oTR containing tRNA using a micro magnetic immunoaffinity extraction. It led to the enrichment of oTR containing tRNA to more than 99 % against isoprenoid cytokinin containing tRNA. Three types of magnetic particles were tested and the best results were provided by using chitosan microparticles CHIT2 with immobilized monoclonal polyspecific antibodies prepared against oTR. Their binding capacity was 0,90 ? 0,09 pmol of oTR containing tRNA per miligram of microparticles. Furthermore, a suitable mixed matrix of 3-hydroxypiconilic and anthranilic acid and optimal conditions for sequencing ssDNA primers using mass spectrometry with MALDI ionization were found. However, the application of this sequencing method to transfer RNA was not successful. …víceméně