Analýza parametrů humorální imunity včel – Bc. Jiří DANIHLÍK

Anotace:

Včelstva jsou ohrožována mnoha chorobami, které působí rozsáhlé ekonomické i ekologické škody. Studium imunitního systému včel je důležité pro získání nových poznatků o vlivu patogenů na včelí jedince nebo i celá včelstva. Imunitní systém včel je tvořen z dílčích částí a to z fyzikálních bariér, buněčné a humorální imunity, jejíž součástí jsou také antimikrobiální peptidy. Teoretická část obsahuje stručný náhled na imunitní systém včel s podrobným zaměřením na antimikrobiální peptidy. Praktická část obsahuje vývoj a testování několika různých přístupů k detekci antimikrobiálních peptidů ve včelích homogenátech. První dvě metody, polyakrylamidová elektroforéza s transferem rozdělených peptidů na membránu a extrakce peptidů na iontoměničové pevné fázi kombinovaná s koncovou HPLC-DAD detekcí, nebyly dostatečně selektivní a citlivé pro požadovanou rutinní analýzu. Poslední testovaná metoda je založená na kombinaci extrakce peptidů z homogenátu na kationtoměničových extrakčních discích s odsolením na C8 reverzní fázi a analýzou nanokapilární chromatografií na C8 fázi s hmotnostní detekcí v MS módu (Q-TOF). Tato metoda je s ohledem na nutnost použití nanokapilární chromatografie relativně robustní a velmi citlivá, protože umožnila analýzu antimikrobiálních peptidů v homogenátu připraveného z jedné včely. Byl stanovován obsah apidaecinu, jeho prekurzoru a abaecinu u vybraných skupin včel: kontrolní skupina (K), skupina včel uměle nakažená bakterií E. coli (IM), včely ze včelstva s klinickými příznaky viru pytlíčkového plodu (SBV) a včely z celkově oslabeného včelstva (EV). Bylo zjištěno, že hladina apidaecinu se významně mění mezi jednotlivými skupinami včel. Na rozdíl od apidaecinu, změny hladin jeho prekurzoru mezi skupinami K, IM a EV nebyly významné. Výjimku tvořila skupina SBV, kde obsah prekurzoru byl asi 9násobně vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou. Změny v obsahu abaecinu mezi jednotlivými skupinami včel také nebyly statisticky významné. Je patrné, že metoda postavená na kombinaci kationtoměničové purifikaci s nanoLC-MS analýzou nabízí možnost rutinní analýzy antibakteriálních peptidů ve včelách. Vzhledem k citlivosti metody je možné získat nová data o výskytu těchto peptidů, jejich hladinách a změn v jednotlivých včelách nebo i v celých včelstvech jako odezvu na výskyt různých chorob. …víceméně

Abstract:

Bees are endangered by many diseases, which can cause large economic and ecologic damages. It is important to study the bee´s innate immune system to get new insights on the influence of pathogens to a single bee or tow hole bee hives. The bee innate immune system involves physical barriers, cellular response and humoral immunity, which involves also antimicrobial peptides. The theoretical part of this work is focused on the humoral immunity and on antimicrobial peptides in detail. The practical part includes the development and testing of several different methods for the detection of antimicrobial peptides in bees. Two methods, polyacrylamide gel electrophoresis and blotting to membranes, and ion-exchange solid phase extraction combined with HPLC-PDA detection, were not selective and sensitive enough as required for routine analysis. The last tested method combines a purification step on a cation-exchange extraction disc, and a desalting step on a C8 reversed phase extraction disc, and analysis on a nanocapillary chromatography with mass spectrometry detection in positive MS mode (Q-TOF). This method is quite robust and sensitive because it was possible to detect antimicrobial peptides from only one bee. There were three antimicrobial peptides, apidaecin, its precursor, and abaecin, quantified in four different groups of bee?s sample: a control group (K), an artificially infected group (IM), bees from a bee hive with Sack brood virus (SBV) and bees from a very weak and poor bee hive (EV). It was observed that the levels of apidaecin were significantly changed among different groups. On the other hand the levels of precursor of apidaecin were not significantly different among groups K, IM and EV, but the group SBV was different. The group SBV had extra high level (9-times higher) of precursor of apidaecin in comparison to the control group. The levels of abaecin were not significantly changed among all analyzed groups. The final optimized method offers a powerful tool for the analysis of antimicrobial peptides in bees. Due to its sensitivity it will be possible to collect a new knowledge about the role of bee´s antimicrobial peptides in bee immunity and function as a response to the infection by bee´s pathogens. …víceméně