Aplikované aspekty kryokonzervace rybích spermií

MSc. Yevhen HOROKHOVATSKYI

Disertační práce

Applied aspects of fish sperm cryopreservation

Abstract:

Kryokonzervace rybích spermií se stala velmi atraktivní kvůli rostoucímu počtu možných aplikací a v posledních desetiletích se značně rozvinula. Od kryokonzervace spermatu ryb se očekává, že zlepší management v líhních, zjednoduší hybridizaci a selektivní chov a poslouží jakožto užitečný nástroj pro biodiverzitu a záchranné programy ohrožených druhů. Kromě toho heterogenita kryorezistence spermií u některých individuálních ryb a silné narušení kvality spermatu a přežití po kryokonzervaci představuje určitou výzvu a brání širší aplikovatelnosti tohoto přístupu. Navíc, heterogenita kryorezistence u spermatu některých jedinců a silné narušení kvality spermatu a jeho přežití po kryokonzervaci představuje dnes určitou výzvu a brání širšímu uplatnění tohoto přístupu. Proto je primárně důležité jednak lepší porozumění mechanismům kryo poškození a jednak vývoj nových a efektivnějších metod pro kryokonzervaci rybího spermatu. V této práci byly zkoumány příčiny individuální variability u kryo odolnosti rybího spermatu a vliv procesu kryokonzervace na parametry kvality spermatu v souvislosti s aplikací nekontrolovaných chladicích zařízeních. Jedním z výstupů této studie je nalezení možných příčin heterogenity kryokonzervace spermií u mlíčáků kapra obecného (Cyprinus carpio). Výsledkem toho byla nalezena negativní korelace mezi změnami v obsahu hlavních lipidových skupin a motility spermatu po kryokonzervaci. Zvláště byla pozorována zvýšená hladina fosfolipidů, cholesterolu a volných mastných kyselin u vzorků s nízkým procentem motility po rozmražení spojená se sníženou kryorezistencí u spermatu kapra obecného. Při zjišťování důsledků aplikace nekontrolovaných chladicích zařízeních na parametry spermií po rozmrazení bylo zjištěno, že sperma jesetera malého může být zamraženo pomocí obou studovaných nástrojů tj. pomocí polystyrenové krabice i suchého přepravního kontejneru. Nicméně kvůli nemožnosti přesně řídit proces ochlazování v těchto dvou zařízeních mohou být chladící podmínky změněny rozdílným množstvím pejet v polystyrenové krabici během mrazení nebo pozicí pejety v suchém přepravním kontejneru. Jako důsledek tyto změny posunují optimální rychlost mrazení potřebnou pro úspěšnou kryokonzervaci spermatu jesetera malého, což vede k poklesu motility spermatu a schopnosti oplození po následném rozmražení. Tyto výsledky naznačují způsob standardizace protokolů kryokonzervace rybího spermatu pomocí volby vhodného množství či pozice pejet, pokud jsou využívány nekontrolovaná chladící zařízení. Nakonec, k prozkoumání účinků kryokonzervace na rybí sperma byla rozpracována technika centrifugace s hustotním gradientem pomocí Percollu a poprvé aplikována na spermie jesetera malého (Acipenser ruthenus). Tato technika umožňuje vybírat a používat pouze populaci spermatu, která přežila proceduru kryokonzervace spermatu, a zároveň zachovává vysoké parametry motility. Bylo zjištěno, že tato subpopulace spermatu vykazuje minimální změny proteinového profilu ve srovnání s čerstvým spermatem. Navíc, rozdíly v mnoha proteinech, které byly nalezeny v suspenzi spermií po zmražení bez separace, jsou spojené s přítomností subpopulací nežádoucích neživotaschopných spermií ve zmražené-rozmražené suspenzi spermatu. Souhrnně, všechny tyto detekované změny v parametrech motility spermatu, jeho životaschopnosti a proteinového složení životaschopného spermatu po zmražení a rozmražení naznačují některé vysvětlení pro mechanismy odpovědné za kryo poškození spermatu a poskytují pozadí pro další vývoj účinných protokolů kryokonzervace. Nicméně by mělo být dále zkoumáno, jestli by separační technika pomocí Percollu mohla slou

Abstract:

Fish sperm cryopreservation becomes highly attractive due to increasing number of potential applications and it has been considerably developed over the past decades. Cryopreservation of fish sperm is expected to improve the broodstock management in hatcheries, simplify hybridization and selective breeding, and serve as a useful tool for biodiversity and conservation of endangered species programs. Nevertheless, its status nowadays is highly contentious due to absence of specific techniques and standardization in the developed protocols. Moreover, the heterogeneity of cryoresistance in sperm of some fish individuals and, strong impairment of the sperm quality and survival after cryopreservation, to date, present some challenges inhibiting wide applicability of this approach. Therefore, a better understanding of the mechanisms of spermatozoa cryo-injuries and the development of new and more effective methods for cryopreservation of fish sperm are of primary importance. In the current work, the causes of individual variability in sperm cryoresistance, influence of cryopreservation process on sperm quality parameters regarding application of uncontrolled cooling devices were investigated. One of the study outputs is the founding the possible causes of sperm cryoresistance heterogeneity in common carp (Cyprinus carpio) males. As a result, a negative correlation between changes in the contents of major lipid classes and sperm motility after cryopreservation was found. In particular, the increased level of phospholipid, cholesterol and free fatty acid in samples with low post-thaw motility percentage were observed and related to decrease in sperm cryoresistance in common carp sperm. In the investigation of the consequence of the application of uncontrolled cooling devices on post-thaw sperm parameters of sterlet sperm, it has been shown that sterlet sperm could be cryopreserved by both Styrofoam box and dry shipper devices studied. However, due to inability to precisely control cooling process in these devices, the cooling conditions can be changed by varying straw number during freezing in Styrofoam box or by straw position during freezing in dry shipper. As a consequence, these changes shift the optimal freezing rates needed for successful sturgeon sperm cryopreservation resulting in decrease in post-thaw sperm motility and fertilization ability. These results suggest the way of standardization of fish sperm cryopreservation protocols by selecting appropriate straw number or straws position when uncontrolled cooling devices are used. Finally, to explore the cryopreservation effects on fish spermatozoa, the Percoll density gradient centrifugation technique was elaborated and applied for the first time to sterlet (Acipenser ruthenus) sperm. That technique allows to select and analyse only the sperm population that survived cryopreservation procedure and saved high motility parameters. It was found that this spermatozoa subpopulation possesses minimal changes in protein profile in comparison to native sperm. Moreover, the differences in many proteins which were found in sperm suspension after cryopreservation without separation is related to the presence of non-viable and sperm wreckage subpopulations in the frozen-thawed sperm suspension. Collectively, all of these detected changes in sperm motility parameters, viability, and protein profiles of viable spermatozoa after freeze-thaw process suggest some explanations for the mechanism responsible for cryodamage of sperm and provides the background for further development of an efficient cryopreservation protocols. However, it should be also further studied if the Percoll separation technique could serve as a useful tool for both better understanding of non-lethal sperm cryodamages and improvement of assisted reproduction practice in sturgeon species.

Abstract:

žit jakožto užitečný nástroj pro lepší porozumění neletálnímu kryo poškození a zlepšení praktiky asistované reprodukce u jeseterů.

Keywords

kryokonzervace rybího spermatu, kryoresistence, chladící zařízení, rychlost zmrazování, kryoprotektivní vliv, životaschopnost spermatu, oplodnění, obsah tuků, proteom, separace pomocí Percollu

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 6. 9. 2018

Obhajoba závěrečné práce

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Fakulta rybářství a ochrany vod

Doktorský studijní program / obor:
Zootechnika / Rybářství