Obsah ATP v bakterii Acidithiobacillus ferrooxidans při oxidaci železa (II) a síry a exprese vybraných genů za anaerobních podmínek

Mgr. Eva Pakostová, Ph.D.

Disertační práce

Cellular ATP levels in Acidithiobacillus ferrooxidans cultures oxidizing ferrous iron and elemental sulfur, and expression of selected genes under anaerobic conditions

Anotace:

Pomocí bioluminiscenčního kitu jsme stanovili buněčný obsah ATP v jednorázových kulturách Acidithiobacillus ferrooxidans oxidujících dvojmocné železo, elementární síru a další redukované sirné látky. Kromě monitorování množství biomasy analýza buněčného ATP dále odhalila specifické metabolické procesy v biooxidaci síry. Metoda byla nejdříve optimalizována na kyselé podmínky a přítomnost inhibitorů. Maximální hodnota buněčného ATP byla 1,16 amol/buňka pro buňky oxidující železo a 0,33 amol/buňka buňky oxidující síru. Významně nižší obsah ATP (P < 0.01) v sirné kultuře byl vysvětlen kontinuální limitací sirným substrátem v důsledku jeho nízké rozpustnosti ve vodě. Po zvýšení pH ve stacionární fázi překvapivě klesl obsah ATP v sirné kultuře. Ačkoliv rychlosti růstu a oxidace se obnovily na původní hodnoty, obsah ATP v kultuře zůstal konstantní v důsledku postupného poklesu buněčného obsahu ATP. Dále byl stanoven buněčný obsah ATP buněk A. ferrooxidans vázaných na povrchu elementární síry na 1,01 amol/buňka. Významně nižší hodnota (P < 0.01) pro planktonickou buněčnou frakci (0,34 amol/buňka) potvrdila hypotézu limitace sírou v planktonických buňkách. Získané výsledky naznačují, že i procentuálně malá část bakteriální populace může zprostředkovávat interakci nezbytnou pro kooperativní mechanismus, kdy oxidace síry nepočetnými vázanými buňkami poskytuje biodostupné substráty pro planktonické buňky. Naše výsledky definují podmínky, za kterých lze bioluminiscenční kit použít k monitorování růstu biomasy při studiu biogeochemické činnosti acidofilních bakterií oxidujících železo a síru. Aby byla vyloučena potenciální limitace kyslíkem během oxidace Fe2+ a elementární síry, byly definovány podmínky minimální aerace pomocí kritických hodnot koeficientu přestupu kyslíku (kLa)crit a kritických koncentrací kyslíku Ccrit. Michaelisova konstanta pro kyslík byla 1,07 μmol O2/l pro oxidaci Fe2+ a 0,61 μmol O2/l pro oxidaci S0. Z respirometrických pokusů byla stanovena nejnižší koncentrace kyslíku, která nelimituje rychlost bakteriální respirace, Ccrit. Pro oxidaci Fe2+ byla stanovena na 6,250 μmol O2/l a pro oxidaci S0 na 3,125 μmol O2/l. Byly také určeny rychlosti oxidace železa a síry při Ccrit sledováním tvorby Fe3+ a H+ v buněčných suspenzích obsahujících příslušný substrát. Ani oxidace Fe2+ ani S0 nebyla při Ccrit limitovaná kyslíkem. Hodnota (kLa)crit potřebná pro udržení kyslíkem nelimitované oxidace substrátu byla 7,70 h−1 pro Fe2+ a 4,88 h−1 pro S0. Pro lepší porozumění mechanismu anaerobní oxidace elementární síry spojené s disimilační redukcí Fe3+ u A. ferrooxidans byly sledovány profily exprese genů energetického metabolismu. Cyc2, cyc1, petA1, petC1, sdrA1, hyp, resB, petB2, petC2, a hip byly indukovány během anaerobního růstu buněk rostlých na Fe2+. Většina genů sirného metabolismu byla exprimovaná na basální hladině nebo byla reprimovaná. Nicméně, hladiny transkripce hdrA, hdrB, p14.3, p21 a tth byly zvýšené na začátku růstu. Na druhou stranu exprese genu sat a operonu sre byla významně snížená. Potlačení exprese cyc2, cyc1 a petA1, cycA1 a cycA2 bylo pozorováno v sirných buňkách, které ztratily schopnost anaerobní redukce Fe3+. Navržený mechanismus zahrnuje: protein Cyc2 na vnější membráně (s předpokládanou funkcí jako terminální Fe3+ reduktasa); periplasmatický přenašeč elektronů rusticyanin; cytochrom c4 CycA1; cytochrom bc1 komplex I na vnitřní membráně; a chinonový pool zajišťující spojení se sirným metabolismem, který zahrnuje heterodisulfidreduktasu, thiosíran:chinonoxidoreduktasu a tetrathionanhydrolasové komplexy. Nicméně alternativní mechanismus, zdá se zahrnuje vysokopotenciálový železo-sirný p

Anotace:

rotein Hip, cytochrom c4 CycA2 a cytochrom bc1 komplex II na vnitřní membráně. Naše výsledky představují alternativu k mechanismu anaerobního procesu dříve publikované práce a indikují metabolickou variabilitu dráhy v rámci kmenů nebo fenotypů.

Abstract:

Cellular ATP content of Acidithiobacillus ferrooxidans batch cultures oxidizing ferrous iron, elemental sulfur and other reduced inorganic sulfur compounds, was determined with a bioluminescence assay whose application was optimised for the use in acidophilic conditions. Apart from usage in biomass monitoring, cellular ATP content analysis revealed specific metabolic processes during elemental sulfur biooxidation. The maximum ATP levels in A. ferrooxidans grown with Fe2+ and S0 were 1.16 and 0.33 amol per cell, respectively. The significantly (P < 0.01) lower ATP content was attributed to a continuous sulfur limitation due to its poor water solubility. The ATP content of sulfur-grown cells decreased anomalously due to a culture pH increase at the stationary phase. Although the rates of growth and sulfur oxidation reached the original levels, the ATP content of the culture remained constant because of gradual decrease in the cellular ATP. Cellular ATP content of A. ferrooxidans attached to elemental sulfur surface was determined to be 1.01 amol per attached cell. The significantly (P < 0.01) lower ATP content in planktonic cells (0,34 amol per cell) confirmed the hypothesis of sulfur limitation. These results suggest that a negligibly small subpopulation may be a link in cooperative interaction whereby sulfur oxidation by attached cells under boundary conditions provides bioavailable substrates to planktonic cells in the population. The obtained results defined conditions under which biomass growth could be monitored by the ATP assay to study biogeochemical activities of acidophilic iron- and sulfur-oxidizing bacteria. The critical values of volumetric oxygen transfer coefficient, (kLa)crit, and oxygen concentration, Ccrit, were used to define the conditions necessary for minimum aeration and to eliminate potential oxygen limitation during iron and sulfur oxidation. The Michaelis constants for oxygen were 1.07 and 0.61 μmol O2/l for the oxidation of ferrous iron and elemental sulfur, respectively. The Ccrit values, below which oxygen limitation may occur, were 6.250 and 3.125 μmol O2/l, determined in respirometric experiments for the oxidation of ferrous iron and elemental sulfur, respectively. The rates of iron and sulfur oxidation were also determined at the Ccrit values by measuring the formation of ferric iron and protons in the corresponding cell suspensions. Neither iron nor sulfur oxidation was limited by oxygen at Ccrit. The (kLa)crit values required to maintain oxygen-unlimited oxidation of ferrous iron and elemental sulfur were 7.70 and 4.88 h−1, respectively. To clarify an anaerobic pathway of S0 oxidation coupled with dissimilatory Fe3+ reduction in A. ferrooxidans CCM 4253 cells we monitored their energy metabolism gene expression profiles. Cyc2, cyc1, petA1, petC1, sdrA1, hyp, resB, petB2, petC2, and hip were induced during anaerobic growth of Fe2+-grown cells. Most sulfur metabolism genes were either expressed at basal level or their expression declined. However, transcript levels of hdrA, hdrB, p14.3, p21 and tth were elevated at the beginning of the growth period. In contrast, expression of the sat gene and sre operon was significantly downregulated. Repression of cyc2, cyc1 and petA1, cycA1 and cycA2 was detected in S0-grown cells that had lost anaerobic Fe3+-reducing ability. The main proposed mechanism involves: the outer-membrane protein Cyc2 (assumed to function as a terminal Fe3+ reductase); periplasmic electron shuttle rusticyanin; c4-type cytochrome CycA1; inner-membrane cytochrome bc1 complex I; and the quinone pool providing connection to the sulfur metabolism machinery, consisting of heterodisulfide reductase, thiosulfate:quinone oxidoreductase and tetrathionate hydrolase complexes. However, an alternative mechanism seems to involve a high potential iron-sulfur protein Hip, c4-type cytochrome CycA2 and the inner-membrane cytochrome bc1 complex II. Our results represent an alternative to ear

Abstract:

lier published findings on an anaerobic process mechanism, indicating strain- or phenotype-dependent pathway variation.

Klíčová slova

Acidithiobacillus ferrooxidans, ATP, oxidace síry, oxidace Fe2+, aerace, anaerobní respirace, redukce Fe3+, reverzně transkripční kvantitativní real-time PCR

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 4. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 20. 5. 2016
• Vedoucí: doc. Ing. Martin Mandl, CSc.
• Oponent: prof. Mgr. Marek Šebela, Ph.D., doc. RNDr. Jiří Gabriel, DrSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie