GTPasy rodiny Rab s nekanonickými způsoby asociace s membránami

Bc. Iveta BĚLICOVÁ

Diplomová práce

GTPases of the Rab family with noncanonical modes of association with membranes

Anotace:

Tato diplomová práce je věnována studiu nekanonických způsobů asociace s membránami u Rab GTPas. Konkrétně je studována potenciální N-myristoylace u skupiny pracovně označované jako Rab32M. V teoretické části jsou obecně popsány Rab GTPasy a posttranslační modifikace proteinů s důrazem na modifikace lipidické, jež jsou klíčové pro asociaci s membránami. Popsáni jsou také zástupci Rab, u kterých byla typická prenylace na C-konci nahrazena myristoylací nebo palmitoylací na N-konci. Teoretická část dále přibližuje kopinatce rodu Branchiostoma, jelikož pro laboratorní analýzu byl vybrán Rab32M protein jednoho z jeho zástupců (konkrétně Branchiostoma floridae). Experimentální část spočívala v přípravě konstruktů a následné expresi Rab32M a enzymu N-myristoyltransferasy z B. floridae v E. coli. Exprimovaný Rab32M byl posléze podroben analýze hmotnostní spektrometrií, která měla za cíl odhalit potenciální N-myristoylaci. Analýza však nepřinesla výsledky, které by přítomnost této modifikace na N-konci jednoznačně potvrdily či vyvrátily. V praktické části byla dále pomocí bioinformatických nástrojů zmapována distribuce Rab32M u živočichů a provedena fylogenetická analýza těchto proteinů. Mimoto byla pomocí programu PSI-BLAST odhalena přítomnost dosud nepopsané C-terminální domény, kterou, jak se ukázalo, Rab32M sdílejí s katalyticky inaktivními proteiny podobnými fosfolipase C.

Abstract:

This thesis studies non-canonical modes of association of Rab GTPases with membranes. Specifically, this work adresses potential N-myristoylation of the Rab32M group. Theoretical part of this thesis deals with Rab GTPases and post-translational modifications of proteins and highlights lipid modifications that are essential for membrane association. Described are also those members of the Rab family that have substituted the typical C-terminal prenylation by N-terminal myristoylation and/or palmitoylation. The theoretical part additionally provides background information on the genus Branchiostoma, because the Rab32M protein chosen for the experimental analysis comes from this organism (specifically the species Branchiostoma floridae). The experimental part of the thesis consisted of preparing DNA constructs and subsequent expression of the Rab32M and N-myristoyl transferase from B. floridae in E. coli. The expressed Rab32M protein was then analyzed by mass spectrometry with the aim to test the presence of N-myristoylation. However, the analysis did not clearly confirm or refute the presence of this modification at the N-terminus. Additionally, in the practical part of this thesis the distribution of Rab32M in Metazoa has been mapped using bioinformatical tools and phylogenetic analysis of these proteins has been performed. Furthermore, using the PSI-BLAST programme, the presence of a hitherto undescribed C-terminal domain as been revealed, which, as it turned out, Rab32M shares with catalytically inactive phospholipases C.

Klíčová slova

Rab GTPasy, posttranslační modifikace, N-myristoylace, Rab32M, Branchiostoma, exprese proteinů, fylogenetická analýza, PSI-BLAST

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 20. 6. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 22. 8. 2016
• Vedoucí: doc. Mgr. Marek Eliáš, Ph.D.

OSTRAVSKÁ UNIVERZITA V OSTRAVĚ

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Experimentální biologie