Možnosti zvýšení efektivity kryokonzervace ejakulátu malých přežvýkavců

Ing. Anežka Málková

Doctoral thesis

Possibilities to increase the efficiency of cryopreservation sperm of small ruminants

Abstract:

Doktorská disertační práce je založena na zhodnocení informací získaných z analýzy beraního spermatu průtokovou cytometrií a CASA přístrojem a možného kvalitativního zlepšení ejakulátu malých přežvýkavců. Disertační práce je pak soupisem čtyř recenzovaných článků ve vědeckých časopisech. Způsoby reprodukce hrají velmi významnou roli v chovu hospodářských zvířat, kdy lze za pomoci umělé inseminace velmi rychle a efektivně zajistit kvalitnější potomky s vyšším genetickým ziskem. Reprodukce v chovu malých přežvýkavců je v České republice převážně přirozená. Zajištěním kvalitních inseminačních dávek po rozmrazení od prověřených plemeníků by potenciálně mohlo dojít ke zlepšení užitkovosti a dostupnosti kvalitních inseminačních dávek plemeníků i z jiných zemí. V rámci doktorské disertační práce byly porovnány různé způsoby kryokonzervace a faktory působící na ni. Byl zjištěn vliv mrazících křivek na kvalitu zmrazeného – rozmrazeného semene beranů plemene valašské ovce, také vliv glycerolu přidaného těsně před mrazením na spermie beranů po zmrazení – rozmrazení. Dále byl zjišťován vliv inhibitorů extracelulárního ledu na neporušenost spermií během ultra-rychlého mrazení a v neposlední řadě byl ověřen vliv věku berana a četnosti vrhu při jeho narození na mrazitelnost spermatu. Statické vystavení parám tekutého dusíku vedlo k nejnižším hodnotám viability, vyššímu poškození plazmatické membrány, akrozomu a mitochondrií, všechny použité modifikované křivky měly pozitivní efekt na výsledné hodnoty spermatu po rozmrazení. Zvláště křivka 2 s nejrychlejším poklesem teploty se ukázala jako optimální. Glycerol je známá kryoprotektivní látka, která je využívána nejen pro mrazení spermatu malých přežvýkavců. Metoda přidání glycerolu po ekvilibraci nijak neovlivnila kvalitu semene po rozmrazení, naopak bylo dosáhnuto lepších parametrů než při použití glycerolu v ředidle po celou dobu ekvilibrace. Pro zamezení tvorby krystalů ledu byl použit syntetický blokátor 1,4-cyklohexandiol,který je nepropustný pro buňky a zamezuje růstu extracelulárního ledu. Byla potvrzena jeho schopnost inhibovat růst extracelulárních ledových krystalů v ředidle AndroMedu®, a také potvrzena jeho netoxicita na beraní spermie. Intracelulární led při ultra-rychlém mrazení hraje při poškození spermií důležitou roli, protože poškození plazmatické membrány spermií bylo zjištěno i u vzorků s 1,4-cyklohexandiolem. Věk a četnost vrhu berana měly vliv na parametry CASA a cytometrické analýzy spermatu. Berani pocházející z dvojčat a berani od věku 3,5 až 4,5 roku a starší měli vyšší viabilitu spermií, vyšší motilitu a progresivní motilitu po rozmrazení spermatu.

Abstract:

The doctoral dissertation is based on the evaluation of the information obtained from the analysis of ram semen by flow cytometry and CASA instrument and the possible qualitative improvement of the ejaculate of small ruminants. The dissertation is then a compilation of four peer-reviewed articles in scientific journals. Methods of reproduction play a very important role in livestock breeding, where artificial insemination can be used to provide better quality offspring with higher genetic gain very quickly and efficiently. Reproduction in small ruminant breeding in the Czech Republic is predominantly natural. Ensuring quality insemination batches after thawing from proven sires could potentially improve the performance and availability of quality insemination batches from sires from other countries. Different methods of cryopreservation and the factors influencing it were compared as part of the PhD thesis. The effect of freezing curves on the quality of frozen-thawed semen of rams of the Wallachian sheep breed was determined, as well as the effect of glycerol added just before freezing on the sperm of rams after freezing-thawing. Furthermore, the effect of extracellular ice inhibitors on sperm intactness during ultra-fast freezing was investigated and last but not least, the effect of ram age and litter frequency at birth on sperm freezability was verified. Static exposure to liquid nitrogen vapor resulted in the lowest viability values, higher damage to the plasma membrane, acrosome and mitochondria, and all modified curves used had a positive effect on the final semen values after thawing. Especially curve 2 with the fastest temperature drop proved to be optimal. Glycerol is a well-known cryoprotective substance that is not only used for freezing semen of small ruminants. The method of adding glycerol after equilibration did not affect the quality of semen after thawing, on the contrary, better parameters were obtained than when glycerol was used in diluent throughout the equilibration period. To prevent the formation of ice crystals, the synthetic blocker 1,4-cyclohexanediol was used, which is impermeable to cells and prevents the growth of extracellular ice. Its ability to inhibit the growth of extracellular ice crystals was confirmed in AndroMed® diluent, and its non-toxicity to ram sperm was also confirmed. Intracellular ice during ultra-rapid freezing plays an important role in sperm damage, as damage to the sperm plasma membrane was also found in samples with 1,4-cyclohexanediol. The age and litter frequency of the ram had an effect on CASA parameters and cytometric analysis of semen. Rams from twins and rams from 3.5 to 4.5 years of age and older had higher sperm viability, higher motility and progressive motility after sperm thawing.

Keywords

inseminační dávky, CASA metoda, kryokonzervace, beraní ejakulát, průtoková cytometrie

Keywords

cryopreservation, flow cytometry, CASA method, ram semen, insemination doses

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2024

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Luděk Stádník, Ph.D.
• Reader: Radek Filipčík, Ing., externi, Jiří Bezdíček, externi, Jan Beran, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Doctoral programme:
Applied Animal Science