Laboratorní diagnostika Clostridium difficile

Romana JANDOVÁ

Bachelor's thesis

Laboratory diagnosis of Clostridium difficile

Abstract:

Clostridium difficile s produkcí toxinů je nejčastějším původcem nozokomiálních střevních infekcí. Způsobuje zánětlivé onemocnění tračníku nazývané Clostridium difficile infection (CDI) různé závažnosti - od banálního průjmu až po život ohrožující stav jako je paralytický ileus a toxické megakolon. C. difficile stále ještě uniká pozornosti laické veřejnosti a stojí v pozadí za jinými bakteriemi, jako je např. MRSA. Clostridium difficile je striktně anaerobní bakterie. Je to grampozitivní tyčinka tvořící oválné subterminální spóry. C. difficile může produkovat dva typy toxinů - a to toxin A (enterotoxin) a toxin B (cytotoxin). Vlivem toxinů dochází k poškození střevního epitelu i hlubších vrstev střevní stěny. Vznikají zánětlivé ulcerace, které se pokrývají pseudomembránami. Některé kmeny produkují ještě binární toxin, jehož přesná funkce zatím není objasněna. Předpokládá se, že potencuje účinek toxinů A a B zvyšováním jejich koncentrace. K průkazu CDI je nutné odebrat vzorek stolice do sterilní zkumavky. Na Pracovišti bakteriologie Nemocnice České Budějovice, a.s. se provádí přímý průkaz antigenu a toxinu imunochromatografickou metodou. Jedná se o membránovou enzymovou imunoanalýzu pro detekci antigenu - glutamát dehydrogenázy (GDH) a toxinu A/B. Negativní výsledek GDH vyloučí s velkou spolehlivostí klostridiovou infekci. Za potvrzenou CDI se považuje průkaz toxigenního kmene C. difficile. To je zřejmé buď přímo z výsledku imunochromatografie, kdy se prokáže zároveň antigen i toxin, nebo průkazem genu pro toxin B metodou PCR. Pokud totiž vyjde v přímém průkazu pozitivní pouze antigen, vzorek se zasílá na PCR vyšetření do Laboratoře molekulární biologie a genetiky. Nezávisle na výsledku imunochromatografie se ze stolice zhotovuje mikroskopický preparát obarvený podle Grama. V případě prokázaného toxinu C. difficile se provádí anaerobní kultivační vyšetření, které trvá dva dny. K identifikaci narostlých bakterií se používá nejčastěji latexová aglutinace. Jde o metodu, kdy se IgG protilátky navázané na latexových partikulích specificky vážou k antigenům buněčné stěny. K identifikaci bakterie lze použít též přístroj VITEK - MS, který používá metodu ionizaci laserem za přítomnosti matrice s následnou hmotnostní spektrometrií. V případě pozitivního kultivačního nálezu Clostridium difficile se z narostlé kultury stanovuje citlivost k antibiotikům pomocí E-testu a diskové difuzní metody. Za rok 2011 bylo na Pracoviště bakteriologie vyšetřeno 291 vzorků stolic. Z nich mělo v imunochromatografickém vyšetření 13,4 % pozitivní antigen i toxin; 15,1 % pozitivní antigen a negativní toxin a 71,5 % bylo negativních. U 74 vzorků byl prokázán toxin C. difficile. U těchto vzorků bylo následně provedeno i kultivační vyšetření - pozitivní bylo v 62,2 %. Nejvíce pozitivních vzorků bylo odesláno z Infekčního oddělení. V počtu vyšetřených pacientů převažovaly ženy, bylo jich 53,6 % a mužů 46,4 %. Procentuální zastoupení toxigenních kmenů bylo u obou pohlaví prakticky totožné - 25 %. Všechny kmeny byly citlivé k vankomycinu a pouze jeden kmen byl rezistentní k metronidazolu.

Abstract:

Clostridium difficile toxin with production is the most common cause of nosocomial enteric infections. It causes inflammatory bowel disease called Clostridium difficile infection (CDI) of varying severity - from trivial diarrhea to life-threatening conditions such as paralytic ileus and toxic megacolon. C.difficile still escapes the attention of the general public and is in the background of other bacteria, such as MRSA. Clostridium difficile is a strictly anaerobic bacterium. It is a gram-positive rod forming an oval subterminal spores. C. difficile can produce two types of toxins - and toxin A (enterotoxin) and toxin B (a cytotoxin). Due to the toxin causes damage of the intestinal epithelium and deeper layers of the bowel wall. Into inflammatory ulceration that cover of the pseudomembrane. Some strains produce more binary toxin, whose exact function is not underwood yet. It is assumed that potentiates the effect of toxins A and B to increase their concentration. To demonstrate the CDI must remove the stool sample into a sterile tube. In the bacteriology workplace in Czech Budweis Hospital is being made direct conclusiveness of antigen and toxin by immuncgromatography method. It is a membrane-enzyme immunoanalysis for the detection of antigen - glutamate dehydrogenase (GDH) and toxin A / B. Negative result excludes GDH with high reliability clostridial infection. For confirmed CDI is considered proof toxigenic strain of C. difficile. This is evident from the result of either immunochromatography which is demonstrated both the antigen and the toxin, or identity of the gene for toxin B by PCR. If you find out in direct detection only positive antigen, the sample is sent for PCR testing to the Laboratory of Molecular Biology and Genetics. Regardless of the outcome of the immunochromatography, the microscopic specimen stained by Gram are being produce from reces. In the case of proven C. difficile toxin is carried anaerobic culture test that takes two days. For identification of accrued bacteria is used latex agglutination. This is a method in which IgG antibodies bound to latex particles specifically bind to the antigens of the cell wall. To identify the bacteria can be also used the VITEK - MS machine that uses a laser ionization method in the presence of the matrix, followed by mass spectrometry. In case of a positive culture findings Clostridium difficile is being from grown culture set sensitivity to antibiotics by E-test and disk diffusion methods For the year 2011 the Department of Bacteriology examined 291 samples of feces. 13,4 % of these samples had positive antigen and toxin in an imunochromatographyc examination; 15,1 % had a positive antigen and negative toxin and 71,5 % were negative. 74 samples was positive in C. difficile toxin. These samples were subsequently conducted to culture examination - 62,2 % were positive. Most positive samples were sent from the infectious department. It has been examined 53,6 % of women and 46.4 % of mens. Percentage of toxigenic strains of both sexes were virtually identical - 25 %. All strains were susceptible to vancomycin and only one strain was resistant to metronidazole.

Keywords

antigen, Clostridium difficile, nozokomiální nákaza, pseudomembranózní kolitida, toxin

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2013

Accessible from:: 3. 5. 2013

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Petra Dovinová

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Health and Social Studies

Bachelor programme / field:
Specialization in Health Service / Health Technician