Strukturní metabolomická analýza vybraných dědičných poruch metabolismu

Mgr. Lucie MÁDROVÁ

Doctoral thesis

Structural Metabolomic Analysis of Selected Inborn Errors of Metabolism

Abstract:

Dědičné metabolické poruchy purinové de novo syntézy (PDNS) tvoří skupinu onemocnění s raritním výskytem. Počet pacientů se pohybuje v jednotkách, maximálně desítkách, a to celosvětově. Komplikovanost diagnostiky je dána jednak nespecifickými klinickými příznaky, ale zejména neexistencí analytických metod vzhledem k nedostupnosti standardů metabolitů PDNS. První část disertační práce je věnována využití techniky hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením k charakterizaci doposud nepopsaného fragmentačního chování meziproduktů PDNS a jejich defosforylovaných forem. Tyto látky byly připraveny pomocí bakteriálních rekombinantních proteinů či chemickou syntézou. Bylo zjištěno, že u většiny těchto metabolitů dochází v prvním stupni fragmentace (MS2) ke štěpení glykosidové vazby. Výjimku tvořily první čtyři ribotidy dráhy PDNS, u nichž docházelo přednostně ke ztrátě vody, fosfátové skupiny nebo štěpení vznikajícího purinového skeletu. Fragmentace byla provedena do 3.-6. stupně a získaná hmotnostní spektra byla uspořádána do formy spektrálních stromů. Dále byla vyvinuta metoda kapalinové chromatografie ve spojení s hmotnostní detekcí, která byla aplikována na CRISPR-Cas9 editované HeLa buňky deficitní v jednotlivých enzymech PDNS. Identita syntetizovaných meziproduktů PDNS byla ověřena porovnáním jejich fragmentačních spekter se spektry analogických metabolitů, které byly produkovány buňkami. K potvrzení fragmentačního chování metabolitů PDNS bylo použito izotopové značení během kultivace buněk. Přístup může být uplatněn při diagnostice poruch PDNS, studiu purinosomu, výzkumu rakoviny, enzymových kinetických studiích a dalších. V rámci druhé části disertační práce byly studovány změny v metabolomickém profilu CRISPR-Cas9 editovaných HeLa buněk, deficitních v jednotlivých enzymech PDNS. Pro komplexní charakterizaci metabolomického profilu buněčných linií byla použita kombinace necíleného a cíleného přístupu metabolomické analýzy. Obě byly provedeny pomocí ultraúčinné kapalinové chromatografie ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Získaná data byla vyhodnocena metodami jedno- a vícerozměrné statistické analýzy. Data z cílené analýzy byla zpracována programem Cytoscape pro jejich lepší vizualizaci. Identita významných metabolitů z necílené analýzy byla potvrzena fragmentací. Ke statisticky významným metabolickým změnám všech PDNS-deficitních linií v porovnání s kontrolou patřily především meziprodukty PDNS. Navzdory významným změnám v purinovém metabolismu nedošlo u PDNS-deficitních buněk k posunu energetického náboje mimo fyziologické rozmezí. Dále byly pozorovány změny v hladinách pyrimidinů, acylovaných karnitinů a metabolitů jednouhlíkového metabolismu. Zjištěné změny v metabolomu PDNS-deficitních buněk mohou představovat obdobné změny nastávající u pacientů trpících poruchami PDNS, a mohou pomoci při studiu těchto nepříliš prozkoumaných chorob.

Abstract:

Defects in purine de novo synthesis are a group of rare inherited metabolic disorders. In total, number of patients does not exceed one hundred worldwide. Diagnosis is complicated due to nonspecific clinicals signs but especially because of analytical reasons (sensitivity) and commercial unavailability of standards of PDNS metabolites. The first part of the dissertation was devoted to the characterization of fragmentation behavior of intermediates of PDNS and their dephosphorylated analogues by means of mass spectrometry which has not been described so far. These compounds were synthesized with the use of bacterial recombinant enzymes or by chemical synthesis. Except for four initial ribotide PDNS intermediates that preferred losing water, phosphate or cleave forming base of purine ring, all the other metabolites studied cleaved the glycosidic bond in the first fragmentation stage. Fragmentation was possible to 3th-6th stages and acquired mass spectra were organized into spectral trees. Liquid-chromatography-high resolution mass spectrometric method was developed and applied in the analysis of CRISPR-Cas9 genome-edited HeLa cells deficient in individual steps of PDNS and salvage pathway. Fragmentation patterns of synthesized metabolites of PDNS were compared with those produced by the cells to confirm the identity of newly synthesized metabolites forming during pathological conditions of both known and theoretical defects of PDNS. Use of stable isotope labelling enabled confirmation of fragmentation mechanisms. The approach might be applicable in diagnosing PDNS deficits, enzyme kinetic studies, formation of purinosomes, cancer research and others. The second part of the dissertation describes metabolic changes of CRISPR-Cas9 genome-edited HeLa cells which were also used in the first study. High performance liquid chromatography coupled with high resolution tandem mass spectrometry were used for both targeted and untargeted metabolomic analyses. Data from the targeted analysis were processed in Cytoscape to better visualize metabolic pathways that were affected the most. Fragmentation analysis was conducted for statistically significant features from the untargeted analysis. The most statistically significant metabolites found in the deficient cell lines compared to controls were the intermediates of PDNS preceding the defective enzyme. Cellular adenylate energy charge of PDNS deficient cells was not deviated out of physiological range compared to controls despite altered pool of adenine and guanine nucleotides. Changes were detected also in the levels of pyrimidines, acylcarnitines, and metabolites of one carbon metabolism. Metabolic changes found in HeLa cells deficient in PDNS represents a model of changes that might be analogical in the cells of patients, and it could be beneficial in understanding these still not well-known enzyme defects.

Keywords

metabolomika, hmotnostní spektrometrie, fragmentace, strukturní identifikace, spektrální stromy, purinová de novo syntéza, HeLa buňky, dědičné metabolické poruchy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 4. 2023

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Tomáš Adam, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Chemistry and Clinical Biochemistry / Medical Chemistry and Clinical Biochemistry