Metabolomické nástroje pro identifikaci nových biomarkerů dědičných metabolických poruch.

Ing. Jan VÁCLAVÍK

Doctoral thesis

Metabolomic tools for identification of new biomarkers of inborn errors of metabolism

Abstract:

Navzdory značnému pokroku v diagnostice a přístrojových technologiích jsou dědičné metabolické poruchy (DMP) stále významnou příčinou úmrtí novorozených dětí. Pro jejich efektivní diagnostiku a následné monitorování pacientů je za potřebí znát specifické biomarkery těchto chorob. U DMP mohou být nové či specifičtější biomarkery odhaleny analýzou vzorků tělních tekutin, popř. tkání získaných od pacientů a kontrol, pomocí necílené metabolomické analýzy. K tomuto účelu lze využít kapalinovou chromatografii ve spojení s vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrií (LC-HRMS). Výsledkem takové analýzy je po statistickém zpracování dat seznam nejvýznamnějších charakteristických signálů poměrů hmotnosti ku náboji (m/z), které mohou zastupovat diagnosticky informativní biomarkery. Nevýhodou tohoto přístupu je nutnost zpětné identifikace molekulové struktury. V této práci byly identifikovány a charakterizovány molekulové struktury neznámých m/z signálů, které byly významně zvýšené ve vzorcích plazmy pacientů s fenylketonurií (PKU) a 3-hydroxy-3-methylglutarovou acidurií (HMGA). Přesná molekulová hmotnost a víceúrovňová fragmentační spektra m/z signálů byla naměřena pomocí hybridního hmotnostního spektrometru s lineární iontovou pastí a orbitální iontovou pastí poskytující vysoké rozlišení. Získaná data byla porovnána se spektrálními databázemi a analyzována softwarem predikujícím fragmentační chování molekul. Uvedený postup vedl ke strukturní charakterizaci nových látek, které mohou být využity v diagnostice a následném sledování pacientů s DMP. V plazmě pacientů s PKU byly charakterizovány dva konjugáty glutamyl-glutamyl-fenylalanin a fenylalanin-glukóza. Oproti hladinám fenylalaninu (Phe), konvenčnímu biomarkeru PKU, vykazovaly tyto látky vyšší variabilitu naměřených hodnot a nižší korelaci s hladinami Phe, což demonstruje jejich potenciální nezávislou informační hodnotu během případného sledování diagnostikovaných pacientů s PKU. V případě HMGA pacientů byly v plazmě charakterizovány neznámé biomarkery jako tři poziční izomery 3-methylglutakonylkarnitinu, které byly shledány selektivnějšími markery než dosud známý 3-hydroxyizovalerylkarnitin. V další studii byla provedena necílená metabolomická analýza plazmy pacientů s HMGA a kontrol. Mezi nejvíce diskriminujícími metabolity mezi skupinami byly kromě 3-hydroxyizovalerylkarnitinu nalezeny také 3-methylglutakonát a 3-hydroxy-3-methylglutarát. Tyto metabolity byly následně kvantifikovány ve 23 vzorcích krevních skvrn HMGA pacientů a 55 kontrol, aby se ověřil jejich diagnostický potenciál pro novorozenecký screening (NBS). Vzorky byly analyzovány kapalinovou chromatografií ve spojení s tandemovou hmotnostní spektrometrii a výsledky přesvědčivě poukazují na možnost rozšířit novorozenecký screening o sledování HMGA pomocí zde prezentovaných specifických biomarkerů.

Abstract:

Despite considerable advancement in diagnostics and technology, inherited metabolic disorders are still a significant cause of newborn deaths. Effective diagnostics and follow-up monitoring require specific biomarkers of these disorders. Novel biomarkers of inherited metabolic disorders can be found by analyzing body fluids of patients and a reference control group of healthy individuals during untargeted metabolomic studies. Liquid chromatography coupled to high-resolution mass spectrometry can be used for this purpose. After statistical evaluation of the data, a result of such analysis is a list of the most significant and characteristic m/z signals that might represent diagnostically informative biomarkers whose structural identities must yet be characterized. The thesis describes the identification and the structural characterization of unknown m/z signals that were significantly increased in samples of patients suffering from phenylketonuria and 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria. Accurate masses and multistage fragmentation spectra of unknown m/z signals were acquired using a hybrid mass spectrometer with linear and orbital ion traps which provides a high-resolution mass spectra. The obtained data were queried against spectral databases and analyzed by software predicting fragmentation behavior of molecules. This methodology led to structural elucidation of novel compounds that might be utilized in diagnostics and follow-up monitoring of patients. Two conjugates of glutamyl-glutamyl-phenylalanine and phenylalanine-glucose were characterized in plasma samples of phenylketonuria patients. These novel markers showed high interpatient variation and did not correlate to levels of a convention biomarker of phenylketonuria, phenylalanine, illustrating their potential added value for follow-up monitoring of these patients. In the case of novel markers for 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria, three positional isomers of 3-methylglutaconylcarnitine, which are more selective biomarkers than currently used 3-hydroxyisovalerylcarnitine, were characterized in plasma samples of patients. The last study described in the thesis is an untargeted metabolomic analysis of plasma samples of 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria patients and age-matched controls. Besides 3-hydroxyisovalerylcarnitine, also 3-methylglutaconate and 3-hydroxy-3-methylglutarate were found among the most discriminating metabolites between patients and controls. These metabolites were then quantified in 23 dried blood spots of patients suffering from 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria and 55 controls in order to evaluate their diagnostic potential for newborn screening programs. Samples were analyzed by liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry and the results clearly demonstrate applicability of these novel markers in newborn screening to diagnose 3-hydroxy-3-methylglutaric aciduria.

Keywords

Metabolomika, strukturní identifikace, biomarkery, novorozenecký screening, dědičné metabolické poruchy, 3-hydroxy-3-methylglutarová acidurie, fenylketonurie, hmotnostní spektrometrie.

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 31. 3. 2020

Thesis defence

• Supervisor: prof. RNDr. Tomáš Adam, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Chemistry and Clinical Biochemistry / Medical Chemistry and Clinical Biochemistry