Testování a optimalizace nové metody pro stanovení aktivity cytidinových deamináz za použití různých buněčných liniích

Bc. Zuzana ZÁLEŠÁKOVÁ

Master's thesis

Testing and optimization of new non-destructive method of determination of cytidine deaminases activity using various cell lines.

Abstract:

Deaminázy jsou enzymy, které jsou součástí záchranné cesty syntézy nukleotidů. V organismech se vyskytují dva typy těchto enzymů, cytidin deamináza a deoxycytylát deamináza. Zatímco cytidin deamináza katalyzuje přeměnu cytidinu a 2'-deoxycytidinu na uridin, respektive 2'-deoxyuridin, deoxycytidinmonofosfát deamináza katalyzuje přeměnu 2'-deoxycytidinmonofosfátu na 2'-deoxyuridinmonofosfát. Velký význam mají tyto enzymy při léčbě nádorových a virových onemocnění cytidinovými analogy, protože velmi často způsobují deaminaci cytidinového analogu na uridinový analog. Tato proměna většinou vede k inaktivaci léčiv a tím ke snížení účinnosti léčby. Mimoto existuje velká variabilita v aktivitě obou deamináz mezi jednotlivými pacienty. To vede k odlišné účinnosti léčby nádorových a virových onemocnění. V předkládané práci byly vyvinuty a testovány tři nové přístupy pro stanovení aktivity deamináz založené na deaminaci 5-etynyl-2'-deoxycytidinu na 5-etynyl-2'-deoxyuridin a následné inkorporaci vzniklého 5-etynyl-2'-deoxyuridinu do buněčné DNA. První metoda je založena na stanovení signálu inkorporovaného 5-etynyl-2'-deoxyuridinu pomocí fluorescenční mikroskopie, druhá využívá pro detekci signálu peroxidázu a následné stanovení absorbance. Třetí metoda je založena na stanovení signálu pomocí fluroescence měřené pomocí čtečky destiček. Jako nejlepší metoda byla vyhodnocena poslední jmenovaná. Tato metoda byla dále využita k testování deaminační aktivity u vybraných buněčných linií. Výsledkem bylo pozorování odlišných deaminačních aktivit mezi jednotlivými buněčnými liniemi, přičemž se ukázalo, že významnou roli hrají oba enzymy, jak cytidin deamináza tak i deoxycytidylát deamináza, a to v závislosti na konkrétní buněčné linii. Současně se ukázalo, že množství enzymů v buňkách jen částečně souvisí se skutečnou deaminační aktivitou.

Abstract:

Deaminases are enzymes that take part in the salvage pathway of nucleotide synthesis. In organisms, there are two types of these enzymes, cytidine deaminase and deoxycytidylate deaminase. While cytidine deaminase catalyses the conversion of cytidine and 2'-deoxycytidine to uridine and 2'-deoxyuridine, respectively, deoxycytidinemonophosphate deaminase catalyses conversion of 2'-deoxycytidinemonophosphate to 2'-deoxyuridinemonophosphate. Both enzymes are very important in the treatment of cancer and viral diseases using cytidine analogues, because they very often cause the deamination of cytidine analogue to uridine analogue. This conversion usully leads to the inactivation of the drugs and thus to the decrease of the effectiveness of the treatment. Moreover, there is a high variability in the activity of both deaminases among particular patients. This variability leads to the different effectiveness of the treatment of the cancer and viral diseases. In the study presented three new approaches for the determination of deaminases' activity based on the deamination of 5-ethynyl-2'-deoxycytidine to 5-ethynyl-2'-deoxyuridine and the followed incorporation of the created 5-ethynyl-2'-deoxyuridine into cellular DNA were developed and tested. The first method was based on the determination of the signal of the incorporated 5-ethynyl-2'-deoxyuridine using fluorescence microscopy, the second method uses the peroxidase followed by the determination of absorbance. The third method is based on the measurement of the fluorescence signal microplate reader. The third approach was evaluated as the best one. This method was further used to test the deaminase activity in chosen cell lines. The different deaminase activities were observed in different cell lines. Both deaminases played important role in deamination of 5-ethynyl-2'-deoxycytidine. Concurrently, it was shown that the amount of enzymes is cells in only partially connected with the real deaminase activity.

Keywords

cytidin deamináza, 2'-deoxycytidylát deamináza, nukleosidové analogy, záchranná syntéza nukleotidů

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 28. 4. 2017

Thesis defence

• Supervisor: RNDr. Karel Koberna, CSc.

PALACKÝ UNIVERSITY OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular and Cell Biology