Oxidative stress in critical illness: effect of cytosolic superoxide dismutase over-expression on oxidative stress and organ function during septic shock

MUDr. Vladislava Šimková, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Úvod: Kromě nadbytku cytokinů a oxidu dusného je právě zvýšená produkcekyslíkových radikálů považována za příčinu poškození orgánů v průběhu sepse nebo endotoxemie. Proto byl otestován předpoklad, že geneticky zvýšena exprese Cu/Zn-superoxid dismutázy (SOD-1) zabrání sepsí vyvolanému zhoršení srdeční funkce a narušení metabolismu uhlovodíků během resuscitovaného septického šoku u myší. V rámci metabolismu uhlovodíků byla pozornost zaměřena na jaterní glukoneogenezi a celotělovou oxidaci glukózy v souvislosti s podáváním noradrenalinu, které je typickým terapeutickým opatřením u pacientů v septickém šoku. Materiál a metody: U divokého typu myší a u heterozygotních a homozygotních myší se zvýšenou expresí SOD-1 byla provedena ligace céka s jeho následnou punkcí nebo jen zdánlivá operace a po 15 hodinách byla započata anestezie a umělá plicní ventilace. U všech myší byl zaveden centrální žilní katetr a levostranný srdeční katetr pro měření tlaku a objemu v levé komoře a perivaskulární průtokové sondy kolem arteria mesenterica superior a vena portae. K udržení normotenzní hemodynamiky byl podáván hydroxyetylškrob a noradrenalin, který byl potřebný jenom u septických myší bez rozdílu mezi genetickými variantami. Jaterní glukoneogeneze a celotělová oxidace glukózy byly vypočteny z obohacení jaterní tkáně 13C-glukózou a vydechovaného vzduchu 13CO2 počas kontinuální intravenózní infúze 1,2,3,4,5,6-13C6-glukózy. V jaterní a srdeční tkáni byla stanovena aktivita SOD a katalázy pomocí komerčních kitů a byla vyhodnocena míra oxidativního stresu jako oxidativní DNA poškození jaterních buněk za pomoci „DNA comet assay“. Výsledky: Ačkoliv průtok arteria mesenterica superior a vena portae (měřen pomocí ultrazvukových průtokových sond) byl u septických myší větší než u zdánlivě operovaných myší, nebyl pozorován obdobný rozdíl v jaterní perfúzi (měřena pomocí laserové Dopplerové průtokometrie) a Hb-O2v mikrocirkulaci (měřeno pomocí remisní spektrofotometrie). Enzymová aktivita SOD v srdeční tkáni byla u heterozygotů pět- a u homozygotů devětnásobně zvýšena, zatímco aktivita katalázy v srdci se nezměnila.Aktivita SOD v játrech byla zvýšena dvojnásobně u heterozygotů a čtyřnásobně u homozygotů. Glykemie a jaterní glukoneogeneze byly porovnatelné mezi jednotlivými genetickými variantami a mezi septickou a kontrolní skupinou, navzdory kontinuálnímu intravenóznímu podávání noradrenalinu, nevyhnutnému u myší v septickém šoku. Oxidace glukózy se v sepsi bez ohledu na genetickou variantu progresivně zvyšovala. Oxidativní poškození DNA v jaterních buňkách (parametr “tail moment” v metodě “comet assay”), které bylo vyvoláno už samotnou operací, nebylo u homozygotů pozorovatelné. Levostranná srdeční funkce byla měřena 18, 21 a 24 hodin od ligace a punkce céka nebo zdánlivé operace. Anestezie a objemová resuscitace způsobily dilataci levého srdce a progresivní pokles středního arterielního tlaku, levostranného komorového tlaku na konci systoly a maximální systolické kontrakce (dp/dtmax), zatímco tepový objem a srdeční výdej se zvyšovaly. U septických myší byla signifikatně zvýšena srdeční frekvence, levostranný komorový tlak na konci systoly, jako i dp/dt max a maximální diastolická relaxace (dp/dt min), a zkrácen čas relaxace levé komory, opět bez rozdílu mezi genetickými variantami. Závěr: Heterozygotní a homozygotní nad-exprese SOD-1 nezlepšila sepsí způsobenou poruchu reakce na podání noradrenalinu v srdečním svalu, ani nezabránila sepsí způsobené poruše metabolismu uhlovodíků, pravděpodobněz důvodu chybějícího vzestupu katalázové enzymové aktivity a/nebo chybějícího účinku SOD na úrovni mitochondrií, jako i z důvodu

Abstract:

samotného kontinuálního podávání noradrenalinu. Nicméně, nad-exprese SOD-1 zabránila oxidativnímu poškození DNA.

Abstract:

Introduction: Besides excess cytokine and nitric oxide production, enhanced oxygen radical formation was referred to contribute to the impaired organ function during sepsis or endotoxemia. Therefore the hypothesis was tested that genetic over-expression of the Cu/Zn-superoxidedismutase (SOD-1) prevent the sepsis-related impairment of myocardial function and carbohydrate metabolism, latter represented by the lack of the norepinephrine-induced increase in hepatic gluconeogenesis and wholebody glucose oxidation during resuscitated murine septic shock.Materials and methods: Wild type, heterozygous and homozygous SOD-1 over-expressing mice were subjected to cecal ligation and puncture or sham operation and, fifteen hours later, anesthetized, ventilated and instrumented with central venous and left ventricular pressure-conductancecatheters and perivascular flow probes around superior mesenteric arteryand portal vein. Hydroxyethylstarch and norepinephrine were infused to maintain normotensive hemodynamics, norepinephrine being necessary in the CLP-mice only, however without any difference related to the mouse strain. Hepatic gluconeogenesis and whole-body glucose oxidation were calculated from liver tissue 13C-glucose and expiratory 13CO2 enrichments during continuous i.v. 1,2,3,4,5,6-13C6-glucose. The heart and liver tissue activities of SOD and catalase were measured using commercial kits and oxidative stress was evaluated measuring oxidative DNA damage by means of DNA comets assay. Results: In the septic mice, continuous norepinephrine infusion resulted in higher superior mesenteric artery flow and consequently portal vein flow (ultrasound flow probes), compared to sham operated mice, what resulted in well-maintained hepatic microcirculatory perfusion (Laser Doppler flowmetry) and Hb-O2 saturation (remission spectrophotometry), without any difference related to the mouse strain. Two-fold and four-fold higher liver tissue SOD activity and five- and nine-fold higher total myocardial SOD activity was observed in the heterozygous and homozygous over-expressing animals, respectively, whereas tissue catalase activity did not differ. Despite continuous i.v. norepinephrine necessary in the CLP-mice, both glycemia and hepatic gluconeogenesis were similar in all groups. Glucose oxidation rate progressively increased in the CLP-groups, again without difference between the genetic strains. The surgery- and CLP-induced increase in the liver cell oxidative DNA damage (tail moment in the comet assay) was not observed in the homozygous mice. Left ventricular function was measured at 18, 21, and 24 hours after CLP or sham-operation. Anesthesia and fluid resuscitation alone caused left ventricular dilatation and a progressive fall in blood pressure, left ventricular end-systolic pressure and maximal systolic contraction (dp/dtmax), while both stroke volume and cardiac output increased. Heart rate, end-systolic pressure as well as dp/dtmax and maximal systolic relaxation (dp/dtmin) were significantly higher and relaxation time significantly lower in the CLP mice, however, without difference between the genetic strains. Conclusion: Hetero- or homozygous SOD-1 over-expression caused neither a sustained improvement of the sepsis-related impairment of myocardial norepinephrine responsiveness, nor did improve the sepsis-related impairment of carbohydrate metabolism, possibly due to the lacking increase of the tissue catalase and/or the mitochondrial SOD activity as well as the ongoing i.v. norepinephrine per se. Nevertheless, SOD-1 over-expression resulted in decreased oxidative DNA damage.

Keywords

superoxiddismutáza, oxidativní stres, sepse, ligace a punkce céka, noradrenalin, laserová Dopplerová průtokometrie, remisní spektrofotometrie, stabilní izotop, kataláza, srdeční funkce, metabolismusglukózy, tlakově-objemová křivka superoxide dismutase, oxidative stress, sepsis, cecal ligation and puncture, norepinephrine, Laser Doppler flowmetry, remission spectroscopy, stable isotope, comet assay, catalase, heart function, glucose metabolism, pressure-volume relation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 4. 11. 2008

Thesis defence

• Date of defence: 3. 12. 2008
• Supervisor: prof. MUDr. Vladimír Šrámek, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
General Medicine / Anesthesiology, Intensive Medicine and Pain Management