Analýza proteinů NOTCH1 a c-MYC u pacientů s chronickou lymfocytární leukémií

Bc. Patrik Čech

Master's thesis

Analysis of NOTCH1 and c-Myc proteins in chronic lymphocytic leukemia patients

Abstract:

Chronická lymfocytární leukémie (CLL) představuje nejčastější typ leukémie v západním světě. Zavedená molekulární diagnostika zahrnuje pouze několik prognostických a prediktivních markerů: mutační status IGVH a aberace v genech TP53 a ATM. Zůstává stále mnoho otázek v porozumění CLL kvůli její významné heterogenitě a nemožnosti léčby. Další biologické faktory, které hrají zásadní roli v patogenezi CLL jsou objevovány a měly by být dále analyzovány ke zlepšení diagnostiky a terapii CLL. U části pacientů jsou dva stěžejní onkoproteiny, c-MYC a NOTCH1, považovány za nezbytné v iniciaci, udržování a progresi CLL. Především závažné typy CLL, jako je Richterův syndrom, jsou spojovány s deregulací v proteinech c-MYC a NOTCH1. Mezi další důležité proteiny u nichž se předpokládá klíčová role v průběhu onemocnění patří také NF-κB a STAT3. V rámci této diplomové práce byly analyzovány proteinové hladiny c-MYC, NOTCH1, NF-κB a STAT3 pomocí imunoblotování a densitometrického vyhodnocování u vzorků CLL pacientů. Dále byla provedena analýza genové exprese c-MYC s využitím RT-qPCR, a také testování KJ-PYR-9, specifického inhibitoru proti proteinu c-MYC v buněčných liniích a u vzorků CLL. Na základě výsledků, nárůst proteinové hladiny c-MYC silně koreloval se zvýšením genové exprese c-MYC. Také byl pozorován vztah mezi hladinou proteinu c-MYC a cytogenetickými aberacemi genu c-MYC. Naproti tomu proteinové hladiny c-MYC a NOTCH1 spolu nekorelovaly, z čehož vyplývá, že NOTCH1 není jediným regulátorem c-MYC. Podobná situace nastala i mezi proteinovými hladinami c-MYC a NF-κB/STAT3, přičemž NF-κB a STAT3 se zdají být stejnoměrně exprimovány bez ohledu na nadbytek proteinu c-MYC. Vztah mezi mutacemi v genu TP53 a proteinovou hladinou c-MYC byl také analyzován, ale nebyla mezi nimi zaznamenána žádná korelace. Testování inhibitoru proti c-MYC, KJ-PYR-9, neprokázalo specifitu v jeho účinku s ohledem na proteinovou hladinu c-MYC u CLL buněk.

Abstract:

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) represents the most frequent form of leukemia in the Western world. Clinically established molecular diagnosis includes only several prognostic and predictive markers such as IGHV mutational status and aberrations in TP53 and ATM genes. As an incurable and particularly heterogenous disease there are still many questions in CLL understanding. Other biological factors that play a crucial role in CLL pathogenesis are emerging and should be further analyzed to improve diagnostics and therapy. Two pivotal oncoproteins, c-MYC and NOTCH1, are now viewed as essential for the CLL initiation, maintenance and progression in a proportion of patients. Especially severe forms of CLL such as Richter syndrome are connected with deregulation in c-MYC and NOTCH1. Additional important proteins such as NF-κB and STAT3 are considered to play key roles in the disease course. Within the scope of this thesis, analyses of c-MYC, NOTCH1, NF-κB and STAT3 protein levels were carried out using imunoblotting and densitometry evaluation in CLL samples. Also gene expression analysis of c-MYC was performed by RT-qPCR technique and testing of c-MYC specific inhibitor KJ-PYR-9 was assessed in CLL samples and cell lines. Based on the results, c-MYC increased protein level strongly correlates with increased c-MYC gene expression. Relationship between c-MYC protein level and c-MYC cytogenetic aberrations was also observed. By contrast c-MYC and NOTCH1 protein levels do not correlate with each other, showing that NOTCH1 is not the only regulator of c-MYC. Similar situation occurs between c-MYC and NF-κB or STAT3 protein levels, where NF-κB and STAT3 appear to be constitutively expressed regardless of c-MYC abundance. TP53 mutations were also analyzed in relation with c-MYC protein level but no correlation was noted. Testing of c-MYC inhibitor KJ-PYR-9 did not show specifity in its effect concerning the c-MYC protein level in CLL cells.

Keywords

Chronic lymphocytic leukemia, c-MYC, NOTCH1, NF-κB, STAT3, TP53, KJ-PYR-9, aberration, western blot, real-time PCR

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2019
• Supervisor: doc. Mgr. Martin Trbušek, Dr.
• Reader: Mgr. Stjepan Uldrijan, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Medical Genetics and Molecular Diagnostics