Ligandy rozpoznávající alternativní struktury DNA: studium vazby ligand-DNA v roztoku a na elektricky nabitých površích a vliv na viabilitu buněk

Bc. Petra Mikušová

Diplomová práce

Ligands recognizing alternative DNA structures: studies of ligand-DNA binding in solution and at electrically charged surfaces and the influence on cell viability

Anotace:

Sekvence DNA bohaté na guanin mohou vytvářet alternativní struktury tzv. guaninové kvadruplexy (G4). G4 mohou být stabilizovány interakcí s nízkomolekulárními látkami tzv. G4 ligandy. V určitých případech může mít stabilizace těchto struktur za důsledek zástavu buněčného cyklu nebo navození apoptotických dějů u nádorových buněk, čehož lze potenciálně využít k terapeutickým účelům. DNA ligandy mohou být také využity k detekci G4 a ke studiu vlastností těchto struktur. V této diplomové práci bylo studováno elektrochemické chování vybraného G4 specifického ligandu, tolylterpyridinového komplexu platiny(II) nesoucího 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoovou kyselinu (Pt-ttPyN3), a jeho interakce se zvolenými oligonukleotidy (ODN) schopnými tvořit G4. Dále byla sledována stabilita G4 ligandu v roztoku pomocí UV-VIS spektrofotometrie a byl analyzován cytotoxický vliv Pt-ttPyN3 na buněčné linie pomocí testů viability, konfokální mikroskopie a westernového přenosu. Pomocí adsorpční přenosové techniky v kombinaci s cyklickou voltametrií byl studován vliv pH základního elektrolytu v rozmezí pH 2,1 − 12 na elektrochemickou redukci Pt-ttPyN3 na visící rtuťové kapkové elektrodě (HMDE). Katalytické redukce H+ v přítomnosti Pt-ttPyN3 bylo využito při studiu interakcí tohoto komplexu s vybranými ODN metodou anodické rozpouštěcí square wave voltametrie v kombinaci s adsorpční přenosovou technikou. Zjistili jsme, že za daných podmínek Pt-ttPyN3 nevykazuje výraznou specificitu ke G4 strukturám vybraných ODN ve srovnání s jejich lineárními dvouřetězcovými formami, ale díky jeho schopnosti katalyzovat vývoj vodíku na HMDE, může být tento komplex použit jako sonda ke studiu adsorbovaných ODN na nabitém povrchu HMDE. Zvolené testy viability využívající sulforhodamin B prokázaly nízkou cytotoxicitu Pt-ttPyN3. Sulforhodamin B však není vhodný pro testování cytotoxicity vysokých koncentrací Pt-ttPyN3 (100 µmol/l). Sledování exprese vybraných proteinů využívaných jako markery zástavy buněčného cyklu a poškození buněk (14-3-3, p53, p21, PARP, PARP-c a aktinu) poukázalo pouze na možnou zástavu buněčného cyklu v G2 fázi, a tudíž nízkou schopnost Pt-ttPyN3 potlačovat růst buněk či způsobovat jejich apoptózu. Ve shodě s tím konfokální mikroskopie neprokázala schopnost Pt-ttPyN3 vstoupit do jádra buňky, nebylo však potvrzeno ani jeho zakoncentrování v cytoplazmě. Z hlediska využitelnosti k případné k léčbě nádorových onemocnění bude tedy vhodné hledat jiné modifikace ligandů vykazující výraznější selektivitu pro G4 a schopnost pronikat do buněčných struktur.

Abstract:

Guanin rich sequences of DNA can create alternative structures so-called guanine quadruplexes (G4). G4 can be stabilized by the interaction with low molecular weight substances so-called G4 ligands. In certain cases, stabilization of these alternative structures may cause cell cycle arrest and induct apoptotic processes in tumour cells, what can potentially be used in antitumour therapeutic strategies. DNA ligands can also be used for G4 detection and study of properties of these structures. Electrochemical behavior of G4 specific ligand: 4-azido-2,3,5,6-tetrafluorobenzoic acid grafted on the platinum(II) tolylterpyridine ligand moiety (Pt-ttPyN3), and its interaction with chosen oligonucleotides (ODN), which are able to form G4, were studied in this diploma thesis. Moreover, G4 ligand stability in solution was checked by UV-VIS spectrophotometry and cytotoxic effects of Pt-ttPyN3 on tumor cell lines were analyzed by viability test, confocal microscopy and western-blotting. The effect of background electrolyte pH in the range 2,1 − 12 on electrochemical reduction of Pt-ttPyN3 was studied by adsorptive transfer technique in combination with cyclic voltammetry at hanging mercury drop electrode (HMDE). Catalytic properties of H+ reduction in the presence of Pt-ttPyN3 where further used to study interactions of this complex with chosen ODNs by anodic stripping square wave voltammetry in the combination with transfer technique. We found out that, under the given conditions Pt-ttPyN3 does not show a significant specificity for G4 structures of chosen ODNs in comparison with their linear double stranded forms, but thanks to its ability to catalyze a hydrogen evolution on HMDE, this complex could be used as a probe for studies of ODN adsorbed on charge surface of HMDE. Chosen viability tests using sulforhodamine B shown low cytotoxicity of Pt-ttPyN3. Sulforhodamine B appeared not to be suitable for monitoring the cytotoxic effects of high concentration of Pt-ttPyN3 (100 µmol/l). Monitoring the expression of selected proteins used as markers of the cell cycle arrest and cell damage (14-3-3, p53, p21, PARP, PARP-c and actin) shown only potential cell cycle arrest in G2 phase, and also a low ability of Pt-ttPyN3 to suppress cell growing or inducing cell apoptosis. Accordingly, confocal microscopy confirmed that Pt-ttPyN3 cannot enter the cell nucleus, but did not confirm if it can concentrate in the cell cytoplasm. It will be desirable to look for other ligand modifications that show greater selectivity for G4 and the ability to penetrate cellular structures, for its eventual application in cancer treatment.

Klíčová slova

buněčné linie, cytotoxicita, DNA, elektrochemie, ligand, katalýza, guaninový kvadruplex, oligonukleotid, viabilita, voltametrie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 6. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 29. 6. 2020
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Oponent: RNDr. Karolina Schwarzová, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie