Charakterizace lipofilních antioxidantů v lupině (Lupinus sp.)

Jitka ČAMKOVÁ

Master's thesis

Characterization of lipophilic antioxidants in lupin (Lupinus sp.)

Abstract:

Tato práce se zabývá charakterizací lipofilních antioxidantů v lupině (Lupinus sp.). Analyzován byl olej získaný z bobů lupiny andské (Lupinus mutabilis sweet), která se vyznačuje vysokou výživnou hodnotou jedlých semen. V lupinovém oleji byly stanoveny karotenoidy (beta-karoten, lutein, zeaxantin) a tokoferoly (alfa-tokoferol, gama-tokoferol, delta-tokoferol). Tyto látky jsou významnými antioxidanty poskytující buněčným strukturám ochranu proti volným radikálům a nežádoucím reakcím. Pro úpravu vzorku oleje byly testovány dvě extrakční metody, a to extrakce kapalina-kapalina a extrakce tuhou fází (SPE). Pro předběžnou identifikaci karotenoidů a tokoferolů v získaných extraktech byla použita tenkovrstvá kapalinová chromatografie (TLC). K separaci byla použita mobilní fáze o složení hexan : aceton : triethylamin; 10 : 4 :1 (v/v/v). Skvrny po TLC separaci byly identifikovány pod UV lampou při vlnových délkách 366 nm (karotenoidy) a 254 nm (tokoferoly). K analýze antioxidantů byla použita vysokoúčinná kapalinová chromatografie v systému reverzních fází (RP-LC), která umožňovala použití coulometrické detekce. Pro analýzu karotenoidů byla použita kolona Macherey-Nagel (3 ?m) 125 x 2 mm a mobilní fáze o složení 50 mmol/l dihydrogenfosforečnan sodný (pH 4,4) : acetonitril; 55 : 45 (v/v). Pro analýzu tokoferolů byla použita kolona Zorbax C8 (5 ?m) 150 x 4,6 mm a mobilní fáze o složení 20 mmol/l mravenčan amonný (pH 4,47) : metanol; 95 : 5 (v/v). K detekci byl použit elektrochemický detektor Coulochem III (ESA, Inc.), který se sestával z coulometrické cely (Model 5010, ESA Inc.) s dvěma průtočnými elektrodami z porézního grafitického uhlíku. Pracovní potenciály byly zvoleny +550 a +600 mV (vs. Pd/H2) pro karotenoidy a +650 a +700 mV (vs. Pd/H2) pro tokoferoly. Mimo RP-LC byl pro analýzu studovaných látek použit také systém normálních fází (NP-LC). Pro separaci analytů byla použita kolona Tessek Separon (7 ?m) 250 x 4 mm, mobilní fáze o složení hexan : isopropylalkohol; 95 : 5 (v/v) pro karotenoidy, resp. hexan : isopropylalkohol; 97 : 3 (v/v) pro tokoferoly. Analyty byly detekovány pomocí UV-VIS detektoru (Shimadzu SPD 10-A VP) při vlnových délkách 450 nm pro karotenoidy a 200 nm pro tokoferoly. Tokoferoly byly také detekovány pomocí fluorescenčního detektoru (Agilent 1200 Series) při vlnových délkách 295 nm (excitační) a 330 nm (emisní). Na základě získaných dat byly jednotlivé analyty identifikovány a kvantifikovány v lupinovém oleji.

Abstract:

This diploma thesis is focused on the characterization of lipophilic antioxidants in lupine (Lupinus sp.). An analyzed oil was obtained from the seeds of Andean Lupine (Lupinus mutabilis sweet), which has been characterized by high nutritional value. In lupine oil were analyzed carotenoids (beta-carotene, lutein, zeaxanthin) and tocopherols (alpha-tocopherol, gamma-tocopherol, delta-tocopherol), that rank among the important antioxidants providing protection against free radicals and undesirable reaction. The sample pretreatment was carried on by using two pre-concentration methods including liquid-liquid and solid phase extraction (SPE). Preliminary experiments were based on the using of the thin layer chromatography (TLC) working in normal phase system with mobile phase composed of hexane : acetone : triethylamine; 10 : 4 : 1 (v/v/v). Separated spots were detected under UV light at 366 nm for carotenoids and 254 nm for tocopherols. Carotenoids and tocopherols were analyzed by using RP-LC with electrochemical detection. A Macherey-Nagel column (125 x 2 mm, 3?m), mobile phase consisting of monosodium phosphate (c=50 mmol/l, pH 4,4) : acetonitrile 55:45 (v/v) were used for separation of carotenoids. Zorbax C8 column (150 x 4,6 mm, 5?m) and mobile phase composed of ammonium formate (c=20 mmol/l, pH 4,47) : methanol; 95 : 5 (v/v) were used for separation of selected tocopherols. A Coulochem III electrochemical detector equipped with a coulometric cell (Model 5010, Esa Inc.) containing two flow-through electrodes made of porous carbon were used. The potential setting on channels were either + 500 mV and 650 mV (vs. Pd/H2) for carotenoids or +650 mV and +700 mV (vs. Pd/H2) for tocopherols detection. The antioxidants were also separated in normal phase system, consisting of Tessek Separon column (250 x 4 mm, 7?m) and two mobile phases. Mobile phase composed of hexane : isopropyl alcohol; 95:5 (v/v) were used for carotenoids and mobile phase consisting of hexane : isopropyl alcohol; 97:3 (v/v) were used for tocopherols separation. The analytes were detected by using UV-VIS detector (Shimadzu SPD 10-A VP) at 450 nm for carotenoids and 200 nm for tocopherols, that were also detected by fluorescence detector (Agilent 1200 Series) at 295 nm excitation and 330 nm emission wavelenght. According to the obtained data, the particular analytes were identified and quantified in lupine oil.

Keywords

lupina, lupinový olej, antioxidační aktivita, karotenoidy, beta-karoten, lutein, zeaxantin, vitamín E, L-L extrakce, SPE, TLC, HPLC

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2014

Accessible from:: 25. 4. 2014

Thesis defence

• Supervisor: Doc. RNDr. David Jirovský, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry