Studium reaktivních forem kyslíku (ROS) při polárním růstu kořenových vlásků Arabidopsis thaliana.

Bc. Jan HABERLAND

Diplomová práce

Study of reactive oxygen species (ROS) during polar growth of Arabidopsis thaliana root hairs.

Anotace:

Reaktivní formy kyslíku patří k významným signálním molekulám, které se zapojují do mnoha procesů v rostlinných buňkách, jako jsou odpovědi na stres nebo diferenciace, a proto je jejich studium velmi důležité k pochopení těchto procesů. Ukázalo se také, že jsou nepostradatelné při polárním růstu rostlinných buněk. Skvělým modelovým systémem polárního růstu u rostlin jsou díky rychlosti růstu a snadné vizualizaci kořenové vlásky. V této práci byly aplikovány fluorescenční sondy CM-H2DCFDA, CellROXTM Deep Red a AmplexTM Red Reagent v kombinaci s pokročilou mikroskopií k časovým a distribučním studiím reaktivních forem kyslíku v kořenových vláscích A. thaliana. Byly použity kontrolní linie Columbia a C24, ale také mutantní linie rhd2-1 s narušenou funkcí NADPH oxidasy, zodpovědné za tvorbu ROS v kořenových vláscích, a der1-3, která má jednobodovou mutaci v genu pro vegetativní isoformu aktinu. Obě mutace vedou k fenotypu velmi krátkých kořenových vlásků. Významným úspěchem v této práci byla aplikace sond CellROXTM Deep Red a AmplexTM Red Reagent pro pozorování v rostoucích kořenových vláscích in vivo, protože nejsou tradičně při studiu rostlinných buněk využívány. Výrazné rozdíly v hladinách ROS byly zjištěny u linie rhd2-1, ale taktéž mezi kontrolními ekotypy. Pomocí sond byla blíže charakterizována lokalizace a vznik ROS v kořenových vláscích, což bylo dále podpořeno doplňkovými experimenty. Kromě toho byly připraveny fluorescenční konstrukty dvou různých superoxiddismutas, u kterých se předpokládá lokalizace a funkce v apoplastu kořenových vlásků.

Abstract:

Reactive oxygen species are important signaling molecules involved in many processes in plant cells, such as stress responses or differentiation, and therefore their study is very important for understanding these processes. They are also involved in the polar growth of plant cells. Root hairs are an excellent model system for polar growth in plants due to their rapid growth and ease of visualization. In this work, fluorescent probes CM-H2DCFDA, CellROXTM Deep Red and AmplexTM Red Reagent were applied in combination with advanced microscopy for spatio and temporal studies of reactive oxygen species in root hairs of A. thaliana. The control lines Columbia and C24 were used, but also the rhd2-1 mutant line with impaired NADPH oxidase function, responsible for ROS generation in root hairs, and der1-3, which has a single-point mutation in the gene for the vegetative isoform of actin. Both mutations lead to a phenotype of very short root hairs. An important achievement in this work was the application of the CellROXTM Deep Red and AmplexTM Red Reagent probes for observation in growing root hairs in vivo, as they are not traditionally used in the study of plant cells. Significant differences in ROS levels were found in the rhd2-1 line, but also between control ecotypes. Using the probe, the localization and formation of ROS in root hairs was further characterized, which was supported by additional experiments. In addition, fluorescent constructs of two different superoxide dismutases, predicted to localize and function in the apoplast of root hairs, were prepared.

Klíčová slova

Arabidopsis thaliana, rhd2-1, der1-3, kořenové vlásky, polární růst, NADPH oxidasa, mikroskopie, reaktivní formy kyslíku, klonování, superoxiddismutasy

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 2. 5. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Lenka Kuběnová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biotechnologie a genové inženýrství / Biotechnologie a genové inženýrství