Izolace a analýza lignanů Schisandra chinensis

PharmDr. Lenka Březinová, Ph.D.

Doctoral thesis

Isolation and analysis of lignans of Schizandra chinensis

Abstract:

Disertační práce se zabývá izolací dibenzo[a,c]cyklooktadienových lignanů rostliny Schisandra chinensis pomocí semipreparativní vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC), dále optimalizováním metody extrakce lignanů a stanovením těchto sekundárních metabolitů v buněčných kulturách Schisandra chinensis in vitro. Schisandra chinensis je velmi často používanou léčivou rostlinou v zemích Dálného východu. Plody a semena této liány se používají po staletí jako tonikum a antitusikum. Účinnými sloučeninami S. chinensis jsou lignany s chemickou strukturou odvozenou od dibenzo[a,c]cyklooktadienu. Tyto lignany mají široké spektrum biologických účinků, včetně hepatoprotektivní, antioxidační, antiproliferativní a antivirové aktivity. Izolace lignanů vycházela z petroletherového extraktu semen S. chinensis, ze kterého byla frakce bohatá na lignany získána extrakcí do methanolu. Methanolový extrakt byl dále frakcionován na sloupci silikagelu. Přečištěním frakcí pomocí semipreparativní HPLC na reverzní koloně byly získány lignany schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, γ-schizandrin a minoritní tigloylgomisin H, tigloylgomisin P, angeloylgomisin H a gomisin J. Vyizolované lignany byly testovány na Biologickém ústavu LF MU na schopnost obnovit citlivost rezistentní buněčné linie plicního karcinomu COR-L23/R exprimující „multidrug resistance protein 1“ k cytostatiku doxorubicinu. Deoxyschizandrin a γ-schizandrin byly schopny statisticky významně zvýšit intracelulární akumulaci doxorubicinu a obnovit citlivost rezistentních buněk k doxorubicinu. V dalším kroku disertační práce byla vyvinuta jednoduchá, rychlá a účinná metoda pro kvalitativní stanovení lignanů ve vzorcích kultur S. chinensis, dále tato metoda byla upravena i pro stanovení obsahu lignanů v médiích a pro stanovení lignanů adsorbovaných na polymerní pryskyřice. Metoda byla optimalizována v krocích – výběr vhodného činidla pro extrakci lignanů z rostlinného materiálu, preseparace vzorku pomocí extrakce na tuhou fázi (SPE) a HPLC analýzy. Jako nejvhodnější činidlo pro extrakci byl vybrán methanol. Vzorky kultur byly extrahovány 3 x 5 ml methanolu, po 3, 3 a 6 hodinách na třepačce (200 ot/min) v termostatu při 45 °C. Odparek z extrakce byl nanesen na kolony Strata C18-E (55 µm, 70A) a byla provedena SPE za sníženého tlaku. Odparek byl nanesen na kolonku ve 2 ml 10% methanolu. Kolona byla promyta 2 ml 40% methanolu a lignany byly eluovány z kolony 2 ml methanolu. Zjistili jsme, že 2 ml methanolu jsou dostatečné pro úplnou eluci všech lignanů (více než 99,5 %), které byly naneseny na kolonu. Jako mobilní fáze pro kolonu Chromolith Performance RP 18e, (100 x 4,6 mm) byl použit 50% vodný roztok acetonitrilu (objemová %) s průtokem 2 ml/min. Lignany byly kvantifikovány UV detekcí při 220 nm. Dalším cílem této disertační práce bylo stanovit obsah lignanů ve vzorcích buněčných kultur s přídavkem elicitorů a polymerních pryskyřic na bázi polystyrenu (Amberlite XAD-2) a na bázi polyakrylesteru (Amberlite XAD-7). Tyto kultury pocházely z Ústavu biologie rostlin Agronomické fakulty Mendlovy lesnické a zemědělské univerzity v Brně. Výsledky popsané v této práci ukazují, že přídavek polymerních pryskyřic, zejména nepolárního amberlitu XAD-2, může být velmi účinný způsob pro převedení lignanů do extracelulárního prostředí a pro zvýšení biosyntézy těchto sekundárních metabolitů buněčnými kulturami S. chinensis. Amberlit XAD-2 adsorboval a zvyšoval především biosyntézu lignanu deoxyschizandrinu a Amberlite XAD-7 zvyšoval u některých linií syntézu wuweizisu C. Lignany adsorbované polymerní pryskyřicí pak mohou být snadno získány bez destrukce buněčné kultury, což je výhodné vzhledem k pomalému růstu kultur.

Abstract:

The doctoral thesis is focused on isolation of Schisandra chinensis dibenzo[a,c]cyclooctadiene lignans using high performance liquid chromatography. This thesis is engaged in optimalisation of methanolic extraction of the sample and the determination of lignans of Schisandra chinensis cell cultures. Schisandra chinensis is a well-known medicinal plant in traditional Chinese medicine. The fruits and seeds from this plant have been used for centuries as a tonic and antitussive. The active ingredients are lignans possessing an unusual structure derived from dibenzo[a,c]cyclooctadiene. These lignans have been shown to possess a broad range of biological effects, including anti-oxidative and hepatoprotective, antiproliferative properties and antivirus activity. To obtain pure lignans, 349 g of Schisandra chinensis seeds were extracted with petroleum ether. The fraction rich in lignans was obtained by extraction of petroleum ether fraction with methanol. Methanol extract was fractionated on silica gel column and subsequently by semipreparative high performance liquid chromatography on reversed phase columns. Eight lignans - schizandrin, gomisin A, deoxyschizandrin, γ-schizandrin and minor lignans tigloylgomisin H, tigloylgomisin P, angeloylgomisin H and gomisin J were isolated. We have attempted to develop a simple and rapid method for quantitative analysis of lignans in cell cultures, liquid media of S. chinensis and added polymeric resins. The method of determination of lignans was optimized in these steps: the choice of an organic solvent for extraction of cell cultures, a solid phase extraction (SPE) and HPLC analysis. Methanol was found to be the most efficient solvent for the extraction of lignans. The samples were tree times extracted with 5 ml of methanol using an orbital shaker set at 120 rpm, 45 ºC, twice for 3 hours and again for 6 hours. Methanolic extracts were used to clean-up the samples by the help of solid phase extraction (SPE). The extracts were re-dissolved in 2 ml of a mixture of methanol and deionized water (1:9, v/v) and loaded onto the cartridges, which were washed with 2 ml of a mixture of methanol and deionized water (4:6, v/v). Lignans were eluted with 2 ml of methanol. With this amount of methanol is washed 99.5 % of all lignans loaded onto the cartridge. The chromatographic separation was carried out on Chromolith Performance RP-18e monolith column (100 x 4.6 mm, Merck) using isocratic mobile phase of acetonitrile and water in the ratio 50:50 (v/v) at a flow rate of 2.0 ml/min. Lignans were determined by the UV detection. The UV detector was set at 220 nm. Another aim of this thesis was the determination of the content of lignans from Schisandra chinensis cultures with addition of elicitors and polymeric resins from polystyrene (Amberlite XAD-2) and from polyakrylester (Amberlite XAD-7). The cell cultures were cultivated at Department of Plant Biology, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry Brno. Results described in this work shows, that the addition of polymeric resins, particularly nonpolar Amberlite XAD-2 can be a very effective tool for releasing lignans into extracellular compartment and for increasing lignan production in S. chinensis culture. Amberlite XAD-2 adsorbed and increased especially total production of deoxyschizandrin. Amberlite XAD-7 enhanced the amount of wuweizisu C in some cell lines. Lignans adsorbed on polymeric resins can be easily recovered and purified without destruction of the cells. This is the advantage of this method, because the cell cultures grow is relatively slowly.

Keywords

Schisandra chinensis, dibenzocyklooktadienové lignany, buněčné kultury Schisandra chinensis, polymerní pryskyřice Amberlite XAD-2, XAD-7

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 12. 1. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 20. 2. 2009
• Supervisor: Mgr. Jiří Slanina, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Medical Chemistry and Biochemistry (4-years) / Medical Chemistry and Biochemistry