Interactions of Microtubule Associated Protein 2c

Mgr. Jitka Plucarová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Protein 2c asociovaný s mikrotubuly (MAP2c) se podílí na regulaci vývoje neuronů. MAP2c interaguje s mikrotubuly a s proteiny buněčných signálních drah, jako je adaptorový protein 2 pro receptor růstového faktoru (Grb2) a extracelulárním sig-nálem regulovaná kináza 2 (ERK2), jenž jsou součástí signální dráhy Ras/mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), a proteinkináza A (PKA), která je součástí cAMP-dependentní dráhy. V rámci této práce byla využita NMR spektroskopie ke zkoumání fosforylace MAP2c modelovou cyklin-dependentní kinázou CDK2 a kinázou ERK2 a ke zkoumání vlivu fosforylace na interakce MAP2c s regulační podjednotkou kinázy PKA RIIα, adaptorovým proteinem Grb2 a doménami homologickými k Src 3 tyrosi-nových kináz Fyn a Abl v rozlišení na úrovni jednotlivých aminokyselinových zbytků. Experimenty ukázaly, že fosforylace MAP2c kinázou ERK2 omezuje interakce se všemi testovanými vazebnými partnery. Interakce s Grb2 byla též omezena fosfory-lací kinázou PKA, a sice v oblasti, která není ovlivněna fosforylací kinázou ERK2. Srovnání fosforylace MAP2c kinázami ERK2 a PKA s fosforylací MAP2c v buněčném extraktu neuroblastomové linie SH-SY5Y odhalilo, že aminokyselinové zbytky, které jsou těmito kinázami fosforylovány nejúčinněji, jsou fosforylovány i v buněčném extraktu. S využitím analýzy perturbací chemického posunu bylo charakterizováno vazebné rozhraní krysího MAP2c fosforylovaného kinázou Fyn a domény proteinu Grb2 homologické k Src 2 (SH2). Na základě výsledků byl navržen model, který vy-světluje rozdíly mezi komplexem SH2 domény proteinu Grb2 s krysím MAP2c fosfo-rylovaným kinázou Fyn a komplexem SH2 domény proteinu Grb2 s vysoce afinitními fosfopeptidy. Dále NMR experimenty odhalily, že MAP2c fosforylovaný kinázou Fyn je schopen interagovat s Grb2 a RIIα-PKA současně.

Abstract:

Microtubule-associated protein 2c (MAP2c) is involved in the development of neu-rons. MAP2c interacts with microtubules and with proteins of the cellular signalling pathways such as growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2) and extracellular signal–regulated kinase 2 (ERK2) of the Ras/mitogen-activated protein kinase (MAPK) signalling pathway and protein kinase A (PKA) of the cAMP-dependent pathway. Within this work, NMR spectroscopy was used to investigate the phos-phorylation of MAP2c by a model cyclin-dependent kinase CDK2 and by ERK2 and to examine the effect of phosphorylation on interactions of MAP2c with the regula-tory subunit RIIα of PKA, adaptor protein Grb2, and Src homology domain 3 of tyro-sine kinases Fyn and Abl in a residue-resolved manner. The experiments showed that MAP2c phosphorylation by ERK2 reduces interactions with all the binding part-ners tested. Moreover, the interaction with Grb2 was reduced by PKA phosphoryla-tion in a region that is not affected by ERK2. Comparison of MAP2c phosphorylation by ERK2 and PKA and phosphorylation of MAP2c in SH-SY5Y neuroblastoma cell extract revealed that the residues that are most efficiently phosphorylated by these kinases are also phosphorylated in the cell extract. Chemical shift perturbation anal-ysis was utilized to characterize the binding interface of rat MAP2c phosphorylated by kinase Fyn and Src homology domain 2 (SH2) of Grb2. Based on the results a model that explains the differences between a complex of SH2 of Grb2 with rat Fyn phosphorylated MAP2c and a complex of SH2 of Grb2 with high affinity phospho-peptides was proposed. Furthermore, NMR experiments revealed that Fyn phos-phorylated MAP2c is able to interact with Grb2 and RIIα-PKA simultaneously.

Keywords

protein 2c asociovaný s mikrotubuly (MAP2c), adaptorový protein 2 pro receptor růstového faktoru (Grb2), cyklin-dependentní kináza 2 (CDK2), extracelulárním signálem regulovaná kináza 2 (ERK2), doména homologická k Src 3 (SH3), doména homologická k Src 2 (SH2), proteinkináza A (PKA), vnitřně neuspořádaný protein, fosforylace, nukleární magnetická resonance, microtubule-associated protein 2c (MAP2c), growth factor receptor-bound protein 2 (Grb2), cyclin-dependent kinase 2 (CDK2), extracellular signal-regulated kinase 2 (ERK2), Src homology 3 (SH3) domain, Src homology 2 (SH2) domain, protein kinase A (PKA), intrinsically disordered protein, phosphorylation, nuclear magnetic resonance

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 9. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 25. 11. 2024
• Vedoucí: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
• Oponent: RNDr. Cyril Bařinka, Ph.D., prof. Ing. Richard Hrabal, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biomolekulární chemie a bioinformatika / Biomolekulární chemie a bioinformatika