Úloha extracelulárně lokalizovaného chaperonu Hsp90 u nádorových buněk

Bc. Ondřej Vacek

Master's thesis

Role of extracellular localization of Hsp90 in cancer cells

Abstract:

Hsp90 je molekulární chaperon, který hraje centrální úlohu při udržování proteostázy účastí na skládání polypeptidů a regulaci degradace poškozených proteinů. Jelikož jednou z dominantních charakteristik neoplázií je právě zvýšená míra proteosyntézy a nestability genomu vedoucí k expresi mutovaných proteinů, není překvapením, že u nádorových buněk také pozorována vyšší hladina i aktivita Hsp90. Tento fenomén vedl k syntéze specifických inhibitorů Hsp90, které jsou jako potenciální terapeutika již testovány v klinických zkouškách. U maligně transformovaných buněk je navíc Hsp90 ektopicky lokalizován v extracelulárním prostoru a napomáhá remodelaci extracelulární matrix a zvyšování buněčné motility. Pochopení regulace extracelulárně lokalizovaného Hsp90 by mohlo umožnit vývoj nových terapeutických strategií, které by byly cílené na schopnost nádorových buněk invadovat do okolí a tvořit metastázy. Cílem této práce bylo na modelu buněčných linií karcinomu prsu popsat vztah mezi celkovou a extracelulární hladinou Hsp90 a blíže charakterizovat úlohu extracelulárního Hsp90 při importu inhibitorů Hsp90 do buněk. Na zkoumání uvedených fenoménů byly použity metody western blotting, průtoková cytometrie a fluorescenční mikroskopie. Výsledky této práce ukazují na provázaný vztah mezi expresí Hsp90, hladinou jeho extracelulárně lokalizované frakce a mírou importu fluorescenčně značeného inhibitoru Hsp90, geldanamycinu. Jako potenciální mechanismus transportu tohoto inhibitoru přes membránu byla identifikována endocytóza, ale nelze vyloučit příspěvek i jiných mechanismů s povahou aktivního transportu. Vliv modulace exprese Hsp90 na import jeho inhibitoru popsaný v závěru této práce poukazuje na zajímavé možnosti, které by mohla přinést kombinace inhibice Hsp90 a jiných již ověřených terapeutických strategií.

Abstract:

Molecular chaperone Hsp90 plays a central role in maintaining protein homeostasis by aiding nascent proteins in reaching their native conformation and promoting damaged proteins for degradation. Since the dominant characteristic of cancer cells is increased proteosynthesis and proliferation, it is then to no surprise, that both elevated levels and increased activity of Hsp90 have been found across many types of tumors. This observation lead to the design of therapeutic strategies based on specific inhibition of Hsp90 and several inhibitors of Hsp90 have already entered clinical trials. Recently, a novel role for Hsp90 was identified on a plasma membrane of cancer cells, where it participates in tumor invasiveness and metastasis. Better understanding of this cancer-specific ectopic expression of Hsp90 might shed new light on selective targeting of Hsp90 and enable development of new treatments with increased effectiveness and reduced target-related toxicity. Aim of this thesis is to investigate the role that the extracellular Hsp90 might play in cellular uptake of specific Hsp90 inhibitors as well as to identify the dependence of extracellular Hsp90 level on basal Hsp90 expression. Western Blotting, flow cytometry and fluorescence microscopy were used to characterize the mechanism of import of fluorescently labeled Hsp90 inhibitor geldanamycin and to describe the relationship between the total and extracellular level of Hsp90. Our results on a panel of seven breast cancer cell lines showed a strong correlation between Hsp90 expression, the plasma membrane level of Hsp90 and cellular uptake of geldanamycin. It was also observed, that the modulation of Hsp90 expression proportionally affects the import of geldanamycin into cancer cells, further supporting previous findings. While endocytosis was identified as a potential transport mechanism of Hsp90-bound geldanamycin across the plasma membrane, other means of active transport still remain a possibility. While the precise mechanism of Hsp90 inhibitor uptake into cancer cells remains to be elucidated, these findings highlight the importance of extracellular Hsp90 in Hsp90 targeted therapy.

Keywords

Hsp90, extracelulární Hsp90, nádorové buňky, karcinom prsu, chaperon, inhibice Hsp90, extracellular Hsp90, cancer cells, breast cancer, chaperone, inhibition of Hsp90

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 4. 6. 2018
• Supervisor: Mgr. Michal Pastorek, Ph.D.
• Reader: doc. Mgr. Petr Beneš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics