Alternativní sestřih exonu 3 genu SERPING1 a aktivace neutrofilů v kontextu patogeneze hereditárního angioedému

Mgr. Tereza Grymová, Ph.D.

Doctoral thesis

Alternative splicing of the exon 3 SERPING1 gene and neutrophil activation in the context of hereditary angioedema pathogenesis

Anotácia:

Hereditární angioedém (HAE) je autosomálně dominantně dědičné onemocnění charakterizované recidivami otoků podkoží a sliznic. Nejčastější typ HAE (HAE-C1INH) je způsoben mutacemi v genu SERPING1 kódujícím C1 inhibitor (C1-INH). Typickým znakem je variabilita klinických projevů, nezávislá na typu mutace. Tato disertační práce je proto zaměřena na potenciální faktory modulující projevy HAE-C1INH - alternativní sestřih exonu 3 genu SERPING1 a aktivaci neutrofilů. Analýza alternativního sestřihu byla zaměřena především na variantu vynechání exonu 3 a variantu -15, využívající slabé alternativní 3’ss 15 nt proti směru transkripce od autentického 3’ss. Tyto varianty byly detekovány jak v minigenu, tak endogenně v buňkách HepG2, lidských játrech a buňkách lidské periferní krve. Varianta vynechání exonu 3 s předčasným stop kodonem, představující téměř třetinu všech sestřihových variant, zřejmě nepodléhá degradaci prostřednictvím nonsense-mediated decay. Vysoká míra exprese této varianty by u pacientů mohla přispívat k nižší plazmatické hladině funkčního C1INH. Varianta -15, která je mimo jiné příkladem dosud nepopsané koregulace dvou velice blízkých 3’ss, zachovává čtecí rámec a protein z ní potenciálně vznikající by obsahoval dvě přídatná glykosylační místa, která by mohla podpořit protizánětlivé působení C1INH. Další výsledky poukazují na aktivovaný pohotovostní stav a dysregulaci neutrofilů pacientů s HAE-C1INH v asymptomatickém období. Tomu nasvědčuje zvýšení relativní mRNA exprese genů spojených s aktivací neutrofilů, zvýšená povrchová exprese CD11b, snížení povrchové exprese CD16 a zvýšení relativního počtu CD274+ a CD87+ neutrofilů pacientů ve srovnání s neutrofily zdravých dárců. Funkční test prokázal přítomnost neutrofilů inhibujících T lymfocyty, které by mohly pacientům poskytovat ochranu před rozvojem autoimunitních onemocnění. Sledování alternativních sestřihových variant exonu 3 genu SERPING1 a aktivace neutrofilů by mohlo pomoci předvídat průběh onemocnění u daného pacienta a případně i optimalizovat terapeutickou intervenci.

Abstract:

Hereditary angioedema (HAE) is an autosomal dominant disorder manifesting as recurrent submucosal and subcutaneous edemas. The most common HAE type (HAE-C1INH) is caused by mutations in the SERPING1 encoding C1 inhibitor (C1INH). Its typical feature is clinical symptom variability independent of the mutation type. This Ph.D. thesis is thus focused on the potential factors modulating HAE-C1INH symptoms - exon 3 SERPING1 alternative splicing and neutrophil activation. Alternative splicing analysis was focused mainly on exon skipping variant and -15 variant using weak 3’ss located 15 nucleotides upstream from the authentic 3’ss. These variants were detected both in minigene, and endogenously in HepG2 cells, human liver, and peripheral blood cells. An exon skipping variant with a premature stop codon, representing nearly one-third of all splicing variants, is probably not degraded by nonsense mediated decay. A high expression level of this variant could contribute to a lower functional C1 inhibitor plasmatic level in patients. -15 variant which is an example of so far undocumented co-regulation of very close 3’ss, preserves a reading frame, and protein potentially arising from a transcript including this variant would contain two additional glycosylation sites, which may emphasize its anti-inflammatory activity. The next results suggest an activated emergency state and patients’ neutrophils dysregulation in an asymptomatic period. It was indicated by increased relative mRNA gene expression associated with neutrophil activation, increased CD11b and decreased CD16 surface expression, and increased CD274+ and CD87+ relative neutrophil counts compared to healthy donors. The functional test showed the presence of neutrophils suppressing T-lymphocytes in patients, which may provide protection from autoimmune disease development. Monitoring alternative exon 3 SERPING1 splicing variants may help to predict disease course in certain patient and eventually optimize therapeutic intervention.

Kľúčové slová

hereditární angioedém, alternativní sestřih, SERPING1, exon 3, aktivace neutrofilů, asymptomatické období, hereditary angioedema, alternative splicing, neutrophil activation, asymptomatic period

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 7. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 9. 2020
• Vedúci: prof. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.
• Oponent: doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc., doc. MUDr. Pavlína Králíčková, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / odbor:
Medical Microbiology, Immunology and Pathology / Medical Microbiology and Immunology