Detekce skrytých přenašečů dědičné katarakty u psů pomocí PCR

Bc. Barbora FARKOVÁ

Diplomová práce

PCR-based detection of hidden carriers of cataracts in dogs

Anotace:

Dědičná katarakta je jednou z nejrozšířenějších onemocnění očí u psů. U psů plemene Stafordšírský bullteriér došlo k tak masivnímu rozšíření této dědičné nemoci, že je v České republice zavedeno povinné testování alespoň jednoho jedince z chovného páru. Jedná se o degenerativní onemocnění čočky, kdy postižený jedinec do 3 let trvale oslepne. V České republice se již delší dobu nevyskytují jedinci postiženi touto nemocí, ale stále se objevují skrytí přenašeči, které je třeba odhalit, aby nežádoucí alely mohly být vyloučeny z genofondu. Cílem této práce bylo otestovat jednoduché metody odběrů biologického materiálu, vyzkoušet je v praxi a ověřit, zda jsou vhodné k izolaci DNA a dále otestovat alternativní metodu molekulární detekce tohoto onemocnění. Celkem byly odebrány stěry bukální sliznice od 23 psů a fen plemene Stafordšírský bullteriér. Detekce skrytých přenašečů dědičné katarakty se prováděla pomocí PCR analýzy se specifickými primery. Získané amplikony byly detekovány pomocí gelové a čipové elektroforézy a pomocí fragmentační analýzy. Detekce přenašečů byla založena na přítomnosti 2 amplikonů (detekce heterozygotů). V mé práci jsem došla k závěru, že pro detekci skrytých přenašečů je nutné používat fragmentační analýzu z důvodu rozdílu pouze jedné báze ve sledovaném úseku DNA. Gelová ani čipová elektroforéza neposkytuje tak vysoké rozlišení a není možné detekovat dva fragmenty lišící se pouze o jeden bp. Jako nejvhodnější metodu odběru DNA jsem zvolila stěry bukální sliznice cytologickým kartáčkem a izolaci DNA metodou chelex s následným přečištěním vzorku.

Abstract:

The hereditary cataract is one of the most common eye disease in dogs. The expansion of this disease in the Staffordshire bullterrier breed has been so massive that in the Czech Republic was introduced the rule of mandatory testing of at least one of a breeding pair. This is a degenerative disease of the lens causing total blindness of the affected animal within three years. Since some time ago there are no more dogs affected by the disease in the Czech Republic, there are however still hidden carriers which need to be discovered to the complete extinction of the disease in the genome. The goal of this study was to test simple ways of collecting biological samples, try them in practice and to verify whether they are suitable for the DNA isolation and also to test an alternative method of molecular detection of this disease. In total there have been 23 buccal swabs collected from male and female Staffordshire Bullterrier examples. The detection of the hidden carriers of the hereditary cataract was carried out by PCR analysis with specific primers. The obtained amplicons were detected by both gel and chip electrophoresis and by using fragment analysis. This detection of the carriers was based on the presence of two amplicons (heterozygotes). I came to conclusion that to detect hidden carriers it is neccessary to use the fragment analysis because of the difference of only one base in the reference section of DNA. Neither gel nor chip electrophoresis does provide sufficiently high resolution and it is not possible to detect two fragments that differ only by one bp. As the most appropriate sampling method I have chosen the buccal smear by cytological brush followed by isolating the DNA by Chelex with purification of the sample subsequently.

Klíčová slova

pes, izolace DNA, katarakta, molekulární markery, PCR

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 24. 4. 2015

Zveřejnit od: 24. 4. 2015

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D.

JIHOČESKÁ UNIVERZITA V ČESKÝCH BUDĚJOVICÍCH

Zemědělská fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Zemědělské inženýrství / Živočišné biotechnologie