Vývoj programu HOTSPOTTER pro výběr „hot spot” pozic pro účely proteinového inženýrství

Bc. Antonín Pavelka, Ph.D.

Diplomová práce

HotSpot Wizard - Tool for Selection of Protein Engineering Hot Spots

Anotace:

Diplomová práce je zaměřena na vývoj bioinformatického nástroje pro identifikaci pozic vhodných k mutagenezi za účelem změny substrátové specificity, aktivity a enantioselektivity enzymů. Pravděpodobnost vytvoření enzymu s novými katalytickými vlastnostmi je větší při cílení mutací do pozic v aktivním místě nebo tunelech, než pro mutace prováděné v jiných místech proteinové struktury. Ovšem mutace pozic, které jsou v průběhu evoluce vysoce konzervované, protože jsou důležité pro stabilitu nebo funkci enzymu, často vede ke ztrátě aktivity enzymu. Mutageneze variabilních pozic, které se účastní vazby substrátu, stabilizace tranzitního stavu nebo odchodu produktů, je užitečným přístupem proteinového inženýrství. Webová aplikace HotSpot Wizard integruje informace z několika databází a výpočetních nástrojů a pomáhá identifikovat pozice vhodné pro mutagenezi založené na tomto přístupu. Základem analýzy je struktura proteinu. Na počátku výpočtu jsou ve struktuře pomocí databází Catalytic Site Atlas a UniProt identifikovány katalytické zbytky. Následně jsou určena aktivní místa a pomocí nástroje CAVER jsou identifikovány tunely, která je spojují s okolním rozpouštědlem. Nástroj CASTp je využit pro identifikaci kapes obsahující aktivní místa. Nakonec je určena evoluční konzervovanost jednotlivých pozic pomocí nástroje ConSurf. Výsledky jsou uživateli prezentovány interaktivním zobrazením sekvence, struktury a tabulek, které obsahují jednotlivé pozice seřazené podle jejich vhodnosti pro mutagenezi. Aplikace zpřístupňuje komplexní bioinformatickou analýzu experimentátorům bez znalosti počítačového modelování a racionálního designu proteinů a šetří čas zkušenějším uživatelům. Relevance výsledků byla testováno pomocí enzymů odlišných struktur a funkcí. Kromě toho, výsledky aplikace byly porovnány s experimentálními daty z mutageneze haloalkan dehalogenázy DhaA. HotSpot Wizard je dostupný na adrese http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/.

Abstract:

The Master Thesis is focused on the development of a bioinformatics tool for the identification of hot spot sites for rational engineering of substrate specificity, activity and enantioselectivity of enzymes. Mutations, which targets the residues located in the active sites or lining the access tunnels, have a better chance to produce enzyme variants with novel catalytic properties, than mutations localized in other parts of the protein structure. On the other hand, replacement of the amino acid residues that are highly conserved through evolution due to their essential role for the structural stability or functionality, may lead to the loss of enzymatic activity. Mutagenesis of variable sites, which contributes to the substrate binding, transition state stabilization or product release, represents a useful concept in protein engineering. The web application HotSpot Wizard integrates the information from several bioinformatics databases and computational tools to assist users with the selection of sites suitable for mutagenesis according to this concept. The input and a central point of the analysis is a protein structure. First, catalytic residues from Catalytic Site Atlas and UniProt database are mapped onto the structure. Then, the position of the active site is estimated and tunnels connecting active site with solvent are calculated by CAVER. Pockets are calculated by CASTp and the pockets containing active sites are identified. Finally, evolutionary conservation of individual positions is estimated by ConSurf. The results are then visualized using interactive display of the sequence, structure and tables listing individual sites prioritized by their suitability for mutagenesis. The application makes the complex bioinformatics analysis accessible to experimentalists with no prior knowledge of computer modeling and rational design of proteins and saves time for more experienced users. It may be useful for developers of software that needs to access the databases or results of the structural and phylogenetical analyses. The relevancy of the results was tested using enzymes of diverse structures and functions. Furthermore, data from experimental mutagenesis of haloalkane dehalogenase DhaA were compared with the HotSpot Wizard results. HotSpot Wizard is available at http://loschmidt.chemi.muni.cz/hotspotwizard/.

Keywords

protein engineering, rational design, substrate specificity, catalytic activity, enzyme, enantioselectivity, evolutionary conservation, structural analysis, bioinformatics, web server

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 1. 2009

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 11. 2. 2009
• Vedoucí: prof. Mgr. Jiří Damborský, Dr., RNDr. Filip Andres
• Oponent: Ing. Matej Lexa, Ph.D.

Masarykova univerzita

Fakulta informatiky

Magisterský studijní program / obor:
Aplikovaná informatika / Bioinformatika