Regulace syntézy aminokyselin s rozvětveným řetězcem u aktinomycet

Ing. Jan KOPECKÝ

Doctoral thesis

Regulation of branched-chain amino acid synthesis in actinomycetes

Abstract:

A set of Streptomyces cinnamonensis mutants with an increased metabolite flow through the branched chain amino acid biosynthetic pathway was analyzed by assessing the activities of enzymes catalyzing the pathway steps. Three mechanisms of the pathway deregulation were identified, all of them affecting acetohydroxy acid synthase (AHAS): (i) insensitivity to the feedback inhibition, (ii) elevated enzyme activity, or (iii) combination of the both. In the parental strain and selected regulatory mutants, the genes ilvB and ilvN encoding the large (catalytic) and small (regulatory) AHAS subunits, respectively, and their regulatory region were sequenced. No changes were found in the regulatory region, i.e. promoter, ribosome binding site, leader peptide, and attenuator, providing no explanation for the increased AHAS activity. On the contrary, in the mutants with AHAS insensitive to feedback inhibition, mutations were found in either regulatory or catalytic subunits, and were proved to be responsible for the observed phenotype. The changes in the sequence of ilvN in mutant strains were of two different types. Certain point mutations were located in the conserved domain near the N terminus, resulting in amino acid residue substitutions G16D, V17D and L18F. Mutations in other strains conferring the same phenotypic change shortened the protein by inserting stop codone behind V104 or V107. Changes in the catalytic subunit were found in the mutants, where AHAS was apparently activated by valine in vitro. Deletion of Q217 affected a distant helix in ?-domain, while substitution E139A occurred in a conservative loop near the active center. To reveal possible impact of individual mutations on self-association of the AHAS holoenzyme, the strength of the subunit-subunit interactions were assayed. The catalytic subunit mutations, E139A and ?Q217, as well as regulatory subunit mutations G16D and V17D and shortening of the regulatory subunit to 107 residues affected the interaction indicating that the affected regions might be in contact with the matching subunit during allosteric regulation. In contrast, replacement of the adjacent L18 residue pointing inwards with phenylalanine did not influence the interaction implying that L18 may participate in valine binding or conformational change transfer.

Abstract:

U sady mutantů Streptomyces cinnamonensis se zvýšeným tokem metabolitů biosyntetickou drahou aminokyselin s rozvětveným řetězcem byly analyzovány aktivity enzymů katalyzujících jednotlivé stupně dráhy. Byly popsány tři mechanismy deregulace, vždy prostřednictvím změny vlastností synthasy acetohydroxykyselin (AHAS): (i) necitlivost ke zpětnovazebné inhibici, (ii) zvýšená aktivita enzymu, (iii) kombinace obou předchozích. Z rodičovského kmene a vybraných mutantů byly sekvenovány geny ilvB a ilvN kódující velkou (katalytickou) a malou (regulační) podjednotku AHAS, a jejich regulační oblast. Žádné změny nebyly nalezeny v regulační oblasti, t.j. promotoru, ribosomálním vazebném místě, leader peptidu a atenuátoru, nebylo tedy možné vysvětlit zvýšení aktivity AHAS. Naproti tomu u mutantů, kde byla AHAS necitlivá ke zpětnovazebné inhibici, byly nalezeny mutace v regulační nebo katalytické podjednotce, a byla prokázána jejich odpovědnost za zjištěný fenotyp. Změny v sekvenci genu ilvN byly u mutantních kmenů dvojího typu. Část mutací byla lokalizována v konzervované oblasti u N-konce a vedla k substitucím G16D, V17D a L18F. Mutace v jiných kmenech způsobující stejnou změnu fenotypu zkracovaly protein insercí stop kodónu za V104 nebo V107. Změny v katalytické podjednotce byly nalezeny u mutantů, u nichž byla AHAS zdánlivě aktivována valinem v podmínkách in vitro. Delece Q217 ovlivnila odlehlou šroubovici v ?-doméně, zatímco k substituci E139A došlo v konzervované smyčce poblíž aktivního centra. Pro posouzení případného vlivu mutací na asociaci holoenzymu AHAS byla měřena síla interakce mezi podjednotkami. Mutace v katalytické podjednotce, E139A a ?Q217, podobně jako mutace v regulační podjednotve G16D a V17D a zkrácení podjednotky na 107 aminokyselinových zbytků, interakci ovlivňovaly, a měly tedy pravděpodobně vliv na regiony zajišťující kontakt s odpovídající podjednotkou při allosterické regulaci. Naproti tomu nahrazení zbytku L18, jehož postranní řetězec směřuje dovnitř, nemělo vliv na sílu interakce. L18 se tedy může účastnit buď přímo vazby valinu, nebo přenosu konformační změny.

Keywords

synthasa acetohydroxykyselin, allosterická inhibice, ilvN, ilvB, Streptomyces cinnamonensis

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 5. 2012

Accessible from:: 17. 5. 2012

Thesis defence

• Supervisor: Doc. RNDr. Martin Rulík, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Ecology and Environmental Protection / Ecology