Príprava vektorov pre CRISPR/Cas9 editáciu SIMK génu a stabilná transformácia lucerny siatej (Medicago sativa L.)

Peter ŠÁLY

Bakalářská práce

Preparation of CRIPSR/Cas9 vectors for editing SIMK gene and stable transformation of alfalfa (Medicago sativa L.)

Anotace:

Prokaryotické organizmy už dlhú dobu využívajú CRISPR/Cas ako silnú a účinnú stratégiu v obrane proti vírusovým útočníkom. CRISPR/Cas9 technológiu je možné využiť k modifikácii genómových sekvencií na dosiahnutie požadovaných vlastností v rôznych organizmoch, vrátane rastlín. Úspešná aplikácia a validácia CRISPR/Cas9 systému v zložitom genóme, ako má lucerna siata, povedie k veľkému pokroku v zlepšovaní tejto plodiny. Lucerna siata (Medicago sativa L.) je významná kultúrna plodina pestovaná pre jej vysoké nutričné hodnoty a prirodzené obohacovanie pôdy. V teoretickej časti bakalárskej práce je predstavená táto hospodársky významná rastlina s dôrazom na jej regeneráciu pomocou somatickej embryogenézy. Taktiež sú charakterizované mitogénom-aktivované proteínkinázy (MAPK) a spôsob ich aktivácie a inaktivácie. Bližší záujem je daný na MAPK objavené u rodu Medicago. U lucerny siatej bola identifikovaná SIMK ako MAPK indukovaná soľným stresom a elicitormi. MAPK sú signálne molekuly zabezpečujúce reakciu rastliny na biotický a abiotický stres. V poslednej časti teórie je predstavená CRISPR/Cas9 metóda. Je ukázaný prehľad histórie, od objavu palindromatických sekvencií až po modernú metódu na cielenú editáciu genetickej informácie, ktorá bola napokon ocenená Nobelovou cenou za chémiu. V neposlednom rade je zhrnutý prehľad použitia CRISPR/Cas9 u lucerny siatej. Hlavným cieľom bakalárskej práce bolo navrhnúť a pripraviť CRISPR/Cas9 konštrukty na vyradenie SIMK génu. Tieto konštrukty boli následne zaklonované do vhodných vektorov a transformované do chemokompetentných baktérií Escherichia coli a Agrobacterium tumefaciens. Rastliny lucerny boli stabilne transformované pripravenými konštruktami a prvé rastliny boli overené pomocou PCR genotypovania so špecifickými primermi.

Abstract:

Prokaryotic organisms have long used CRISPR/Cas as a powerful and effective strategy in defending against virus attackers. CRISPR/Cas9 can be used to modify genomic sequences to achieve desired properties in a variety of organisms, including plants. Successful application and validation of the CRISPR/Cas9 system in a complex genome, such as the alfalfa, will lead to significant progress in improving this crop. Alfalfa (Medicago sativa L.) is an important crop grown for its high nutritional values and natural soil enrichment. The theoretical part of the bachelor thesis presents this economically important plant, emphasizing its regeneration by somatic embryogenesis. Mitogen-active protein kinases (MAPKs) and their process of activation and inactivation are also characterized. Closer interest is given to MAPKs discovered in the genus Medicago. In alfalfa, SIMK was identified as MAPK induced by salt stress and elicitors. MAPKs are signaling molecules involved in plant response to biotic and abiotic stresses. In the last part of the theory, the CRISPR/Cas9 method is introduced. An overview of history is shown, from the discovery of palindromic sequences to a modern method for targeted modification of genetic information, which was eventually awarded the Nobel Prize in Chemistry. Finally, a summary of the use of CRISPR/Cas9 in alfalfa is summarized. The main goal of the bachelor thesis was to design and prepare CRISPR/Cas9 constructs to knockout the SIMK gene. These constructs were then cloned into appropriate vectors and transformed into the chemocompetent bacteria Escherichia coli and Agrobacterium tumefaciens. Alfalfa was stably transformed with the prepared constructs and the first plants were verified by PCR genotyping with specific primers.

Klíčová slova

Medicago sativa, somatická embryogenéza, MAPK, SIMK, CRISPR/Cas9, stabilná transformácia

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2022

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Miroslava Hrbáčková, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biotechnologie a genové inženýrství / Biotechnologie a genové inženýrství