Rozdíly v produkci reaktivních forem kyslíku a nízkomolekulárních antioxidantů při kultivaci rostlin na světle různé ozářenosti a spektrálního složení

Bc. Radomír PECH, DiS.

Master's thesis

The dissimilar production of reactive oxygen species and low-molecular antioxidants during cultivation of plants under different irradiances and spectral composition of light

Abstract:

Diplomová práce se zabývá rozdíly v produkci reaktivních forem kyslíku a nízkomolekulárních antioxidantů při kultivaci Hordeum vulgare L. v různých světelných podmínkách. Za účelem sledování produkce reaktivních forem kyslíku v rostlinách byla zavedena metoda umožňující detekci a kvantifikaci peroxylovaných lipidů prostřednictvím fluorescenční sondy Spy-LHP. Vlastnosti sondy byly ověřeny standardizací pomocí látky MCPBA (hydrofobní kyselina m-chlorperoxybenzoová), TBHP (hydrofilní tert-butylhydroperoxid) a H2O2 s následnou optimalizací metody pro stanovení a lokalizaci peroxylovaných lipidů v rostlinném materiálu. První experiment se zabýval vlivem spektrální kvality při aklimaci rostlin na vysokou ozářenost. Rostliny byly po týdenním růstu v podmínkách bílého světla nízké ozářenosti (100 ?mol m 2 s 1) vystaveny na dalších sedm dní vybrané spektrální kvalitě (modrá, zelená, červená, bílá) a intenzitě záření (100, 200 nebo 400 ?mol m-2 s-1). Následně bylo stanoveno epidermální UV-A stínění zařízením Dualex, ale také obsah volných fenolových látek HPLC analýzou a antioxidační aktivita s využitím volného radikálu DPPH (vyjádřeno hodnotou TEAC). Z výsledků vyplývá synergický pozitivní efekt modrého světla a intenzity záření na produkci epidermálních, potažmo většiny volných fenolových látek. Tento jev byl pozorován především u kyseliny feruloylchinové, lutonarinu a dalších derivátu isoorientinu, zatímco deriváty isovitexinu vykazovaly závislost na intenzitě záření také ostatních spektrálních variant (RH, GH). Pozitivní účinky modrého světla na antioxidační aktivitu byly pozorovány již při nízké ozářenosti. Dále byla sledována závislost antioxidační aktivity na obsahu fenolových látek. Nejvyšší korelaci vykazoval lutonarin (r = 0,9228), saponarin (r = 0,87) a kyselina feruloylchinová (r = 0,8675). Cílem druhého experimentu bylo posoudit vliv spektrální kvality na produkci nízkomolekulárních antioxidantů a odolnost rostlin proti fotooxidativnímu poškození. Rostliny byly po týdenní kultivaci v podmínkách bílého světla nízké ozářenosti (100 ?mol m 2 s 1) vystaveny po dobu sedmi dní vysoké ozářenosti (400 ?mol m-2 s-1) vybrané spektrální kvality (modrá, červeno-zelená 1:1 a bílá). Odběr sekundárních listů byl proveden v temnostní fázi, po hodinové aklimaci rostlin na světlo, a po 3hodinovém světelném stresu (bílé světlo 400 ?mol m-2 s-1 + UV-B 2 W m-2). Kromě stanovení epidermálního UV-A stínění, antioxidační aktivity a obsahu fotosyntetických pigmentů a volných fenolových látek (metody shodné s prvním experimentem), byla stanovena fotochemická účinnost PSII zařízením FluorPen (FV/FM) a peroxidace lipidů nově zavedenou metodou Spy-LHP. Obsah fenolových látek vykazoval trend podobný prvnímu experimentu, tedy pozitivní efekt modrého světla na akumulaci těchto látek, především lutonarinu a kyseliny feruoylchinové. Obecně byl pozorován pozitivní účinek modrého světla také na akumulaci xantofylů a ?-karotenu. Navíc byly v podmínkách červeno-zeleného světla zaznamenány deriváty chlorofylů s vyšším počtem dvojných vazeb v postranním řetězci. Antioxidační aktivita pigmentů i fenolových látek vykazovala dle hodnoty TEAC trend B > W > GR, čemuž také odpovídá nejnižší obsah peroxylovaných lipidů v rostlinách aklimovaných na modré světlo. Vyšší odolnost těchto rostlin proti fotooxidativnímu poškození se projevila také potlačením negativních účinků UV-B záření na fotochemickou účinnost PSII.

Abstract:

The thesis deals with the differences in the production of reactive oxygen species and low molecular weight antioxidants in leaves of spring barley caused by variations in acclimation light spectral quality and irradiation. For the purpose of measurement production of reactive oxygen species in leaves, a new method which use Spy-LHP probe was established to detect and quantify peroxylated lipids. The properties of the probe were verified by standardization with MCPBA (hydrophobic m-chloroperoxybenzoic acid), TBHP (hydrophilic tert-butylhydroperoxide) and H2O2, followed by optimization of the method for determination and localization of peroxylated lipids in plant material. The first experiment dealt with the influence of spectral quality during plant acclimation to high irradiance. After a week of growth in low irradiance of white light (100 ?mol m-2 s-1), the plants were exposed for another seven days to selected spectral quality (blue, green, red, white) and irradiation (100, 200 or 400 ?mol m-2 s-1). Subsequently, the epidermal UV-A shielding was determined with a Dualex device, as well as content of soluble phenolic substances by HPLC analysis and antioxidant activity using the stable radical DPPH (expressed by TEAC value). The results showed a synergistic positive effect of blue light and irradiance on the production of epidermal, and therefore most soluble phenolic compounds. This effect was observed mainly in case of feruloylquinic acid, lutonarin and also other isoorientin derivatives, while isovitexin derivatives showed also a dependence on the irradiance of other spectral variants (RH, GH). Positive effects of blue light on antioxidant activity were observed even at low irradiance. Furthermore, the dependence of antioxidant activity on the content of phenolic compounds was measured. The highest correlation with AOX was exhibited by lutonarin (r = 0.9228), saponarin (r = 0.87) and feruloylquinic acid (r = 0.8675). The aim of the second experiment was to assess the effect of spectral quality on the production of low molecular weight antioxidants and the resistance of plants to photooxidative damage. After one week of cultivation in low white light conditions (100 ?mol m-2 s-1), the plants were exposed for seven days to high irradiation (400 ?mol m-2 s-1) of selected spectral quality (blue, red-green 1:1 and white). Sampling of secondary leaves was performed in the dark phase, after one hour of plants acclimation to light, and after 3 hours of light stress (white light 400 ?mol m-2 s-1 UV-B 2 W m-2). In addition to the determination of epidermal UV-A shielding, antioxidant activity and content of photosynthetic pigments and soluble phenolic compounds (methods which were all used in pervious experiment), the photochemical efficiency of PSII was determined with FluorPen (FV/FM) and the lipid peroxidation by the newly introduced Spy-LHP method. The content of phenolic compounds showed a trend similar to the first experiment, therefore a positive effect of blue light on the accumulation of these substances, especially lutonarin and feruoylquinic acid was detected. Positive effect of blue light on the accumulation of xanthophylls and ?-carotene was clearly noticeable. In addition, chlorophyll derivatives with a higher number of double bonds in the side chain have been detected under red-green light conditions. According to the TEAC value, the antioxidant activity of pigments and phenolic compounds showed a trend of B> W> GR, which also corresponds to the lowest content of peroxylated lipids in plants acclimated to blue light. The higher resistance of these plants to photooxidative damage was also reflected in the suppression of the negative effects of UV-B radiation on the photochemical activity of PSII.

Keywords

Hordeum vulgare L., spektrální kvalita, intenzita záření, reaktivní formy kyslíku, nízkomolekulární antioxidanty, fenolové látky, fotosynteticky aktivní pigmenty, Spy-LHP, HPLC

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 22. 6. 2020

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Date of defence: 25. 8. 2020
• Supervisor: Mgr. Jakub Nezval, Ph.D.

University of Ostrava

Faculty of Science

Master programme / field:
Applied Physics / Biophysics