Optimalizace kultivačních podmínek vybraných kmenů \kur{E.coli} produkujících rekombinantní proteiny

Bc. Zuzana MICHALCOVÁ

Master's thesis

Optimization of culture conditions of selected {E.coli} strains producing recombinant proteins

Anotácia:

Bakterie Escherichia coli je jedním z nejvíce preferovaných organismů pro produkci rekombinantních proteinů. E. coli je velmi dobře zavedeným hostitelem, který nabízí snadnou genetickou manipulaci, krátkou dobu kultivace, schopnost kontinuální fermentace a cenově dostupná kultivační media. Pro dosažení vysoké úrovně proteinové exprese, a tedy vysoké produkce rekombinantního proteinu je třeba provádět optimalizace kultivačních podmínek. Právě na optimalizaci kultivace se zaměřuje tato diplomová práce, kde praktická část je zaměřena na produkované enzymy uridin fosforylázu (UP) a purin nukleosid fosforylázu (PNP). Bakterie E. coli produkující UP nebo PNP byly kultivovány na šesti mediích s různými zdroji živin. Produkce proteinů byla ověřena na spektrofotometru metodou dle Bradfordové a dále pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy s SDS (SDS-PAGE). Aktivita enzymů byla měřena HPLC analýzou. Dále byla u všech vzorků stanovena sušina. Na základě výsledků z těchto analýz bylo vybráno medium Terrific Broth s přídavkem glukózy po 4 hodinách kultivace (TBG4), které bylo následně použito pro upscaling do fermentoru. Úspěšná kultivace ve fermentoru potvrdila výsledky kultivace v Erlenmeyerových baňkách.

Abstract:

Escherichia coli is one of the most preferred organisms to produce recombinant proteins. E. coli is a well-established host that offers ease of genetic manipulation, short culture times, continuous fermentation capability and affordable culture media. To achieve high levels of protein expression, and therefore high recombinant protein production, optimization of culture conditions is required. This thesis is focused on the optimization of cultivation, the practical part is focused on the production of Uridine Phosphorylase (UP) and Purine Nucleoside Phosphorylase (PNP) enzymes. E. coli bacteria producing UP or PNP were cultured on six media with different nutrient sources. Protein production was verified on a spectrophotometer by the Bradford assay and further by polyacrylamide gel electrophoresis with SDS (SDS-PAGE). Enzyme activity was measured by HPLC assay. In addition, the dry weight biomass was determined for all samples. Based on results from these assays, Terrific Broth medium with glucose addition after 4 h of cultivation (TBG4) was selected and subsequently used for upscaling to the fermenter. Successful cultivation in the fermenter confirmed the results of cultivation in Erlenmeyer flasks.

Kľúčové slová

Escherichia coli, rekombinantní proteiny, kultivace, upscaling, produkce rekombi-nantních proteinů

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 4. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: prof. Ing. Vladislav Čurn, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Agriculture and Technology

Master programme / odbor:
Agroecology / Agroecology - Specialization Organic Agriculture