Příprava proteinu HP1 beta a jeho charakterizace hmotnostní spektrometrií

Bc. Marko Vrábel

Bachelor's thesis

Preparation of HP1 beta protein and its characterization by mass spectrometry

Abstract:

Heterochromatin Protein 1 (HP1) is an evolutionarily conserved chromosomal protein that binds to methylated lysin 9 of histone H3 (H3K9me). HP1 plays a key role in the formation of higher order chromatin structures. It is clear now that this protein also has other functions in the nucleus, including regulation of euchromatic genes or response to DNA damage. The HP1 protein is accessible to post-translational modifications that are likely to regulate these different functions. Differences in function or chromosomal location are also characteristic for individual isoforms of HP1 protein. This bachelor thesis deals with the preparation of HP1 β protein for mass spectrometry-based proteomic analysis. The practical part deals with the optimization of enzymatic cleavage conditions and the impact of immunoaffinity enrichment and sample fractionation on the quality of target protein identification. The obtained results show that for a given amino acid sequence of the HP1β protein it is desirable to prepare a sample for characterization by mass spectrometry by various approaches. Enrichment of the protein from the complex mixture was found to be a necessary step. Higher sequence coverage was achieved by the parallel use of different endoproteinases and the inclusion of prefractionation techniques.

Abstract:

Heterochromatín proteín 1 (HP1) je evolučne konzervovaný chromozomálny proteín, ktorý sa viaže k methylovanému lyzínu 9 histónu H3 (H3K9me). HP1 hrá kľúčovú rolu pri vytváraní chromatínových štruktúr vyššieho rádu. Dnes už je zrejmé, že tento proteín má v jadre aj iné funkcie, vrátane regulácie euchromatických génov, či odpovede na poškodenie DNA. Proteín HP1 je prístupný posttranslačným modifikáciam, ktoré pravdepodobne tieto odlišné funkcie regulujú. Rozdielmi vo funkcií či chromozomálnom umiestnení sa vyznačujú aj jednotlivé izoformy proteínu HP1. Táto bakalárska práca sa venuje príprave proteínu HP1 β pre následnú proteomickú analýzu pomocou hmotnostnej spektrometrie. Praktická časť sa zaoberá optimalizáciou podmienok enzymatického štiepenia a dopadu imunoafinitného obohatenia a prefrakcionácie vzorky na kvalitu identifikácie cieľového proteínu. Zo získaných výsledkov vyplýva, že pri danej aminokyselinovej sekvencii proteínu HP1β je pre charakterizáciu hmotnostnou spektrometriou žiadúce vzorku pripraviť rôznymi prístupmi. Ukázalo sa, že úplne nevyhnutným krokom bolo obohatenie proteínu z komplexnej zmesi. Vyššieho sekvenčného pokrytia bolo docielené paralelným použitím rôznych endoproteináz a zaradením prefrakcionačných techník.

Keywords

proteomika, príprava vzorky, enzymatické štiepenie, proteomická analýza, hmotnostná spektrometria, proteín HP1, proteomics, sample preparation, digestion, proteomic analysis, mass spectrometry

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2019

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2019
• Supervisor: Mgr. Gabriela Lochmanová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry