Molekulárně genetická charakterizace transgenních linií ječmene s modifikovanou expresí mitogenem-aktivované protein kinasy MPK4.

Mgr. Elizaveta CHUBAR

Bachelor's thesis

Molecular and phenotypic characterization of transgenic barley lines with modified expression of mitogen-activated protein kinase MPK4

Abstract:

Pomocí molekulárních a fyziologických metod byly charakterizovány transgenní linie ječmene s umlčením genu HvMPK4 (RNAi) a transgenní linie ječmene s nadprodukcí genu HvMPK4 (nadprodukční). PCR genotypování prokázalo přítomnost kompletních T-DNA kazet u celkem osmi nezávislých transgenních RNAi linií a u celkem jedenácti transgenních nadprodukčních linií. V práci byla také ověřena spolehlivost rychlého a jednoduchého genotypování transgenních rostlin ječmene pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Pomocí Multiplex TaqMan qPCR byli v T2 generaci RNAi linií a v T1 generaci naprodukčních linií identifikovány rostliny potenciálně homozygotní v T-DNA inzercích. Spolehlivost predikce genotypů těchto jedinců byla potvrzena prokázáním uniformity jejich potomstva v hygromycinové rezistenci pomocí in vitro testu hygromycinové rezistence. Analýza exprese pomocí RT-qPCR ukázala, že potomci pěti nezávislých RNAi linií měli v T3 generaci minimálně čtyřikrát nižší množství mRNA HvMPK4 než kontrolní rostliny a, že potomci osmi nezávislých nadprodukčních linií měli v T2 generaci čtyřikrát až osmkrát větší množství mRNA HvMPK4 než kontrolní rostliny. Nebyl pozorován žádný rozdíl v dynamice vadnutí nadzemní části rostliny u potomků vybraných RNAi, nadprodukčních a kontrolních linií v průběhu působení sucha.

Abstract:

Molecular and physiological methods were used for the characterization of transgenic barley lines bearing silenced HvMPK4 gene (RNAi) and of transgenic barley lines overexpressing HvMPK4 gene (overexpression). PCR genotyping confirmed presence of complete T-DNA insertions in eight independent transgenic RNAi lines and in eleven transgenic overexpression lines. In addition, reliability of the fast and easy in vitrohygromycine resistance assay for the genotyping of transgenic barley plants was confirmed. Plants potentially homozygous in T-DNA insertions were identified in T2 generation of RNAi lines as well as in T1 generation of overexpression lines by means of Multiplex TaqMan qPCR. Reliability of the genotype prediction of these individuals was confirmed by resistance of all their progenies to hygromycine as determined with in vitro hygromycine resistance assay. The RT-qPCR expression analysis showed that T3 generation progenies of five independent RNAi lines contained at minimal four times less HvMPK4 mRNA than control plants, whereas T2 generation progenies of eight independent overexpression lines contained four to eight times more HvMPK4 mRNA than control plants. No difference was observed in the shoot wilting dynamics among progenies of selected RNAi, overexpression and control lines during exposure to drought stress.

Keywords

transgenóze, Hordeum vulgare, HvMPK4, hygromycinová rezistence, Multiplex TaqMan qPCR, sucho

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2018
• Supervisor: Ing. Pavel Křenek, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering