Cílená mutageneze cytokinindehydrogenasy z Chroococcidiopsis thermalis

Marie DOLEŽALOVÁ

Bakalářská práce

Site-directed mutagenesis of cytokinin dehydrogenase from Chroococcidiopsis thermalis

Anotace:

Cytokinindehydrogenasa (CKX; EC 1.5.99.12) je flavoenzym, který obsahuje kovalentně navázaný kofaktor flavinadenindinukleotid (FAD). Kofaktor FAD je navázán k histidinu, který je součástí konzervovaného vazebného motivu GHS, prostřednictvím vazby 8-N1-histidyl. Cílem experimentální části bakalářské práce byla cílená mutageneze ve vazebném motivu kofaktoru FAD u CKX z Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX), pomocí PCR. ChtCKX obsahuje místo konzervovaného vazebného motivu GHS vazebný motiv AHS a zároveň neobsahuje kovalentně navázaný kofaktor FAD. Pro cílenou mutagenezi byl použit plasmid pTYB12::ChtCKX a primery s požadovanou mutací. Mutagenizovaný plasmid pTYB12::ChtCKX A104G byl vyizolován ze čtyř náhodně vybraných kolonií a následně sekvenován. Vytvoření požadované mutace a správnost nukleotidové sekvence ChtCKX A104G byly vyhodnoceny porovnáním s původní sekvencí genu ChtCKX. U dvou plasmidů došlo v genu ChtCKX k námi požadované mutaci a zároveň nedošlo k jiné nežádoucí mutaci.

Abstract:

Cytokinin dehydrogenase (CKX; EC 1.5.99.12) is a flavoenzyme that contains a covalently bound flavin adenine dinucleotide (FAD) cofactor. The FAD cofactor is bound via the 8-N1-histidyl bond to histidine, which is a part of the conserved GHS binding motif. The aim of the experimental part of the Bachelor thesis was site-directed mutagenesis in the binding motif of the FAD cofactor in CKX from Chroococcidiopsis thermalis (ChtCKX), using PCR. ChtCKX contains an AHS binding motif instead of the conserved GHS binding motif and does not contain a covalently bound FAD cofactor. Plasmid pTYB12::ChtCKX and primers with the desired mutation were used for targeted mutagenesis. The mutagenized plasmid pTYB12::ChtCKX A104G was isolated from four randomly selected colonies and subsequently sequenced. The generation of the desired mutation and the correctness of the nucleotide sequence of ChtCKX A104G were evaluated by comparison with the original sequence of the ChtCKX gene. Two of the plasmids contained the desired mutation in the ChtCKX gene and at the same time did not contain other undesirable mutations.

Klíčová slova

Cytokinindehydrogenasa, flavinadenindinukleotid, kovalentní vazba, cílená mutageneze

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 26. 5. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: doc. RNDr. Jitka Frébortová, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biotechnologie a genové inženýrství