Příprava liposomů s antivirálním účinkem

Bc. Zina Korvasová

Master's thesis

Abstract:

Název práce: Příprava liposomálních preparátů s protivirovým účinkem Abstrakt: Kationické liposomy jsou malé sférické vezikuly tvořené z neutrálního a kationického lipidu v určitém poměru a s vodnou fází uvnitř. Od sedmdesátých let, kdy začaly být liposomy intenzivně studovány, byla nalezena řada postupů přípravy umožňujících cíleně připravit liposomy nejrůznější morfologie a požadované velikosti. Do liposomů mohou být inkorporována léčiva ve vodném kompartmentu nebo vmezeřena do lipidické dvojvrstvy, a tímto způsobem chráněna před přímým kontaktem s okolním prostředím. Cílem práce bylo: 1) ověření metod přípravy liposomů s potenciálem průmyslové aplikace, jejich fyzikálně-chemická charakterizace 2) enkapslulace antivirotik do kationických liposomů a ověření účinku liposomálních nukleotidových antivirotik proti různým isolátům herpesvirů BHV-1 a EHV-1 3) zavedení metod kvantifikace herpesvirů pomocí RT-PCR. Kationické liposomy byly připraveny metodami hydratace lipidového filmu a lyofilizace a jejich velikost a zeta potenciál byly měřeny pomocí fotonkorelační spektroskopie. U liposomů s enkapsulovanými antivirotiky HPMPC a PMEDAP byla spektrofotometricky měrěna enkapsulační účinnost. 4 typy kationických liposomů (CDAN, DC-cholesterol, DoDAB a B30-spermin) byly testovány na penetraci do buněk MDBK. Kvantifikace inkorporace fluorescenčně značených liposomů do buněk byla prováděna průtokovou cytometrií a výsledky byly ověřeny fluorescenční mikroskopií. Liposomy s kationickými lipidy CDAN a B30-spermin se jeví jako perspektivní pro další vývoj a byly použity pro enkapsulaci antivirálních látek HPMPC a PMEDAP, které inhibují DNA polymerásy virů. Pro tato ve vodě rozpustná antivirotika, představuje liposomální forma velmi efektivní způsob zvýšení jeho terapeutického účinku. Výhodou enkapsulace antivirotik do liposomálních preparátů je snazší průnik do buňky, tudíž nedochází ke ztrátám účinné látky mimo buňku, a také toxicita vhledem k volným antivirotikům je výrazně snížena. Anitivirální aktivita volných a liposomálních antivirotik byla prokázána in vitro na tkáňových kulturách infikovaných herpetickými viry BHV-1 a EHV-1 a byly provedeny testy na cytotoxicitu. Kvantifikace herpesvirů byla provedena metodou PCR- real time. Tato metoda byla využita také pro přesnou kvantifikaci antivirové aktivity preparátů in vitro. Liposomy výrazně zvyšovaly penetraci HPMPC do buněk a při krátkodobé inkubaci (6h) in vitro vykazovaly o řád vyšší účinnost ve srovnání s volným HPMPC. Tyto pozitivní předběžné výsledky jsou základem pro další práci na vývoji cílených liposomálních antivirotik.

Abstract:

Title: Preparation of liposomes with antiviral effect Abstract: Cationic liposomes are small, spherical vesicles which consist of neutral and cationic lipids, enclosing an aqueous core. Since 70s it has been developed a plenty of methods that provide opportunity for preparation of liposomes with desired size and morphology. Drugs that are incorporated into the liquid phase or the lipid bilayer are protected from the direct contact with environment. Aims of this study: 1) Evaluation of methods of preparation of liposomes with potential for industrial applications, physico-chemical characterization of liposomes 2) Encapsulation of antiviral nucleotides analogues into cationic liposomes and verification of their in vitro antiviral effect against isolates of herpetic viruses BHV-1 and EHV-1 3) Introduction of methods of quantification of herpes viruses with RT-PCR Cationic liposomes were prepared by lipid film hydration technique or lyofilization from tert-buthanol, parameters of liposomes were measured using photon correlation spectroscopy. Efficiency of encapsulation of HPMPC and PMEDAP antivirotics into liposomes was measured by spectrophotometry. Four types of cationic liposomes (CDAN, DC-cholesterol, DoDAB and B30-spermine) were tested for penetration into MDBK cells and Flow cytometry was used for quantification of this process. Results were confirmed by fluorescent microscopy. Liposomes consisting of cationic lipids CDAN and B30-spermin seem to be perspective for next development and they were used for encapsulation of antiviral drugs (HPMPC and PMEDAP), which are inhibitors of viral DNA polymerase. Liposomal formulation of antiviral drug seems to be promissing for further development of antiviral preparations. The advantage of encapsulation of antiviral drugs into liposomes consists in targeting of drugs to specific cells and enhancing penetration of drugs into cells. Decrease of free drug concentration outside the cells and hence decrease of its toxicity is the desired beneficial outcome of encapsulation of antiviral drugs into liposomes. Antiviral activity of free and liposomal antiviral drugs was demonstrated in vitro on cells cultures infected by BHV-1 and EHV-1 and cytotoxicity tests were performed. Quantification of herpes viruses was performed using real time PCR method. This method was utilized also for exact quantification of antiviral activity of preparations in vitro. Liposomes markedly increased penetration of HPMPC into cells and proved higher efficiency compared with free HPMPC during short incubation (6h). These preliminary positive results are the basic for next development of targeted liposomal preparations.

Keywords

Kationický liposom, antivirotikum, herpesvirus BHV-1, EHV-1, fotonkorelační spektroskopie Cationis liposome, antiviral drug, herpes viruses BHV-1, photon correlation spectroscopy

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 27. 4. 2006

Thesis defence

• Date of defence: 23. 5. 2006
• Supervisor: RNDr. Jaroslav Turánek, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry