Komplexní molekulární diagnostika kongenitální adrenální hyperplazie

Ing. Zuzana Vrzalová, Ph.D.

Doctoral thesis

Complex molecular diagnostics of congenital adrenal hyperplasia

Abstract:

Kongenitální adrenální hyperplazie (CAH) je autozomálně recesivní dědičná porucha tvorby glukokortikoidů a mineralokortikoidů v kůře nadledvin. 90 - 95 % všech případů CAH zahrnuje deficit enzymu 21-hydroxylázy (21-OHD, gen CYP21A2), 5 - 8 % případů deficit enzymu 11β-hydroxylázy (11β-OHD, gen CYP11B1). Mezi vzácněji vyskytující se enzymové poruchy CAH patří deficit 17α-hydroxylázy (17α-OHD, gen CYP17A1) a deficit 3β-hydroxysteroidní dehydrogenázy II. typu (3β-HSD II, gen HSD3B2). Příčinou onemocnění je snížená či zcela chybějící aktivita jednoho z uvedených enzymů. Míra snížení aktivity enzymu se odráží v klinické závažnosti onemocnění, a proto CAH tradičně rozlišuje fenotypově těžkou klasickou formu a méně závažnou neklasickou formu. V případě deficitu 21-OHD byla v rámci doktorské práce rozšířena DNA diagnostika zavedením PCR a klasické sekvenace pro analýzu všech exonů a přilehlých intronových sekvencí genu CYP21A2 včetně jeho 5´a 3´ nepřekládaných oblastí. Dále byla zavedena MLPA analýza pro detekci rozsáhlých intragenových přestaveb. V průběhu let 2003 - 2013 byl prokázán deficit 21-OHD u 375 probandů z České republiky. Celkem bylo identifikováno 37 typů mutantních CYP21A2 alel. Nejfrekventovanější skupinu představovaly mutantní alely nesoucí bodové mutace (62,6 %), z nichž nejčastěji se vyskytovaly mutace c.290-13A/C>G a p.(Ile172Asn). Mutantní alely nesoucí chimérní CYP21A1P/CYP21A2 gen zahrnovaly 29,2 %, celkově byly identifikovány 4 typy. Mutantní alely s totální delecí CYP21A2 genu byly detekovány ve 4,5 % a vzácně zastoupené (0,4 %) byly mutantní alely nesoucí duplikovaný CYP21A2 gen s bodovými mutacemi c.290-13A/C>G a p.(Gln318*). U 26 probandů, klinicky i biochemicky diagnostikovaných jako CAH, byla identifikována mutantní CYP21A2 alela pouze na jednom chromozómu. Proto se lze pravděpodobně domnívat, že u 3,3 % CAH pacientů nebyly doposud identifikovány mutantní CYP21A2 alely. DNA diagnostika deficitu 11β-OHD byla zavedena metodami PCR a klasické sekvenace pro analýzu všech exonů CYP11B1 genu. Do roku 2013 byla provedena DNA analýza u 60 probandů. U třech z nich byla detekována mutace p.(Arg448His) nebo p.(Arg43Gln) a sekvenční varianta p.(Ala386Val) s nejasným klinickým významem. V prvním případě byla u probanda s klasickým fenotypem identifikována mutace p.(Arg448His) v homozygotním stavu. V dalších dvou případech byli probandi heterozygoti pro mutaci p.(Arg43Gln) a sekvenční variantu p.(Ala386Val), zatímco mutaci na druhé alele se nepodařilo detekovat. V roce 2012 byla molekulárně genetická diagnostika CAH rozšířena zavedením DNA analýzy deficitu 17α-OHD a 3β-HSD II. U 19 vybraných pacientů byla provedena analýza 17α-OHD s pozitivním záchytem u 1 probandky, u které byla identifikována bodová mutace p.(Arg416His) a sekvenační varianta p.(Ile63Thr) s nejasným klinickým významem, obě v heterozygotním stavu. Probandka je dlouhodobě léčena na 17α-OHD na základě jejího klinického obrazu a výsledků biochemického vyšetření. V rámci 3β-HSD II bylo analyzováno 31 pacientů. U jedné pacientky s neklasickou formou CAH byla identifikována sekvenační varianta p.(Val353Met) s nejasným klinickým významem v heterozygotní formě, její podíl na fenotypu pacienta je nejasný vzhledem k předpokládanému autosomálně recesivnímu typu dědičnosti 3β-HSD II.

Abstract:

Congenital adrenal hyperplasia (CAH) is an autosomal recessive hereditary disorder of glucocorticoid and mineralocorticoid production in the adrenal cortex. 90 - 95 % of all cases of CAH include an 21-hydroxylase enzyme deficiency (21-OHD, gene CYP21A2), 5 - 8 % is an 11β-hydroxylase enzyme deficiency (11β-OHD, gene CYP11B1). Deficiency of 17α-hydroxylase (17α-OHD, CYP17A1 gene) and deficiency of 3β-hydroxysteroid dehydrogenase II (3β-HSD II, gene HSD3B2) are ranked among rarely occurring enzymatic disorders of CAH. The reduced or completely absent activity of one of given enzymes is considered to be the cause of this disease. The rate of decrease of enzyme activity is reflected in the clinical severity of the disease and therefore CAH traditionally distinguishes a phenotypically severe classical form and a less severe non-classical form. In the case of 21-OHD deficiency the DNA diagnostics was extended within my doctoralIn the case thesis by introducing PCR and conventional sequencing for analysis of all exons and flanking intron sequences of CYP21A2 gene including its 5' and 3' untranslated regions. Further MLPA analysis has been introduced for detection of large intragenic rearrangements. During years 2003 - 2013 the deficiency of 21-OH was demonstrated in 375 probands from the Czech Republic. The total 37 types of mutant CYP21A2 alleles were identified. Mutant alleles carrying point mutations (62.6 %) represented the most frequent group, of which the most frequently occurring mutations were c.290-13A/C>G and p. (Ile172Asn). Mutant alleles carrying chimeric CYP21A1P/CYP21A2 genes comprised 29.2 %, four types of chimeric genes were identified completely. Mutant alleles with complete deletion of the CYP21A2 gene were detected in 4.5 % and mutant alleles carrying a duplicated CYP21A2 gene with point mutations c.290-13A/C>G and p.(Gln318*) were present rarely (0.4 %). A mutant CYP21A2 allele was identified on only one chromosome in 26 probands that were clinically and biochemically diagnosed as CAH. Therefore, it is possible to assume that with 3.3 % CAH patients the mutant CYP21A2 alleles have not been identified yet. DNA diagnostics of 11β-OHD deficiency has been extended by the introduction of PCR and conventional sequencing for analysis of all exons of the gene CYP11B1. By 2013, DNA analysis was carried out with 60 patients. For three probands, we found mutations p.(Arg448His) and p.(Arg43Gln) and sequential variant p.(Ala386Val) with unclear clinical significance. In the first case, a mutant allele with the mutation p.(Arg448His) in the homozygous state was identified in one proband with the classic phenotype. In two other cases female probands were heterozygotes for a mutant allele mutation p.(Arg43Gln) and sequential variant p.(Ala386Val), while the mutation on the other allele was not detected. In 2012 the molecular genetic diagnosis of CAH was extended by the introduction of DNA analysis of 17α-OHD and 3β-HSD II deficiency. With 19 selected patients the 17α-OH deficiency with positive rate in 1 female proband was identified, for which a point mutation p.(Arg416His) and sequence variant p.(Ile63Thr) with unclear clinical significance, both in the heterozygous state were identified. The proband has been treated for 17α-OHD on the basis of its clinical picture and results of biochemical examinations for a long time. Within the 3β-HS II deficiency 31 patients were analyzed. A sequence variant p.(Val353Met) with unclear clinical significance in heterozygous form was identified with one patient with non-classical form of CAH. Its share of the phenotype of the patient is unclear with respect to the expected autosomal recessive type of inheritance of 3β-HSD II.

Keywords

kongenitální adrenální hyperplazie, deficit 21-hydroxylázy, deficit 11β-hydroxylázy, deficit 17α-hydroxylázy, deficit 3β-hydroxysteroidní dehydrogenázy II, CYP21A2, CYP11B1, CYP17A1 a HSD3B2

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 7. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 2. 10. 2017
• Supervisor: doc. RNDr. Lenka Fajkusová, CSc.
• Reader: RNDr. Iveta Valášková, Ph.D., doc. MUDr. Felix Votava, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Genomics and Proteomics