Molekulární analýza genů spojených s metabolizmem mědi u Silene vulgaris

Ing. Jiří Baloun, Ph.D.

Disertační práce

A molecular analysis of genes connected to a copper metabolism in Silene vulgaris

Anotace:

Silene vulgaris patří mezi rostlinné druhy, které mají schopnost tolerovat vysoké koncentrace mědi v půdě a přestože je to známý metalofyt, jen velmi málo je známo o jeho mechanismech tolerance. V této práci jsme se rozhodli studovat expresní aktivitu genů, které se těchto mechanismů účastní. Pro naše účely jsme si vybrali dva ekotypy S. vulgaris, které pochází ze stanovišť s rozdílnou koncentrací mědi v půdě - k mědi tolerantní ekotyp Lubietová a senzitivní ekotyp Stránská skála. V první části této práce jsme u obou studovaných ekotypů charakterizovali dva geny (metallothionein 3 a Heavy Metal ATPase 7), které se podílí na homeostazi mědi v buňce. Pomocí analýzy BAC knihovny S. vulgaris jsme identifikovali klony obsahující sekvence obou genů. Následně jsme tyto sekvence charakterizovali a identifikovali v nich specifické proteinové domény. V osekvenovaných BAC klonech jsme také objevili, že SvMT3 je v genomu tandemově duplikován. Expresní analýza a kvasinkové komplementační studie ukazují, že obě kopie SvMT3 jsou funkční. Navíc jsme sledovali expresi obou SvMT3 v kořenech i nadzemních částech obou ekotypů při různých koncentracích mědi. Naše analýza ukazuje, že SvMT3a je podobně exprimována u všech studovaný ekotypů, zatímco SvMT3b je v přítomnosti mědi více exprimován jenom v metalofytních ekotypech. Naše data také indikují, že snížená exprese SvMT3b při vyšších koncentracích mědi je pravděpodobně součástí obranné reakce při stresu mědí. Navíc také předpokládáme, že exprese obou SvMT3 je specificky regulována při vlivu určitého těžkého kovu. V BAC klonu jsme identifikovali SvHMA7 se všemi strukturními vlastnostmi specifickými pro ATPázy transportující měď. Navíc byla funkce SvHMA7 ověřena pomocí kvasinkového komplementačního experimentu. Expresní analýzy odhalily, že exprese SvHMA7 je indukovaná při vyšších koncentracích mědi u obou ekotypů. Nicméně tento gen pravděpodobně není zodpovědný za odolnost tolerantního ekotypu k nadbytku mědi. Výsledky našich expresních analýz byly také ověřeny pomocí RNA-Seq databází. Dále jsme se snažili identifikovat geny, které se mohou podílet na obraných reakcích u studovaných ekotypů. Mezi vybranými kandidáty byly geny kódující transportéry mědi a proteiny účastnících se při eliminaci reaktivních forem kyslíku. Naše data ukazují, že tři geny (APx, POD a COPT5) jsou konstitutivně více exprimovány v tolerantním ekotypu. V této práci jsme nalezli expresní rozdíly mezi metalofytním a ne-metalofytním ekotypem, které mohou napomoci k objasnění tolerance mědi u S. vulgaris. Navíc jsme pomocí RNA-Seq databází identifikovali několik potenciálních genů, které se účastní při obraně proti intoxikaci mědi u tohoto rostlinného druhu.

Abstract:

Silene vulgaris possesses ecotype-specific tolerance to high levels of copper in the soil. Although this was reported a few decades ago, little is known about this trait on a molecular level. The aim of this study was to analyse the transcription response to elevated copper concentrations in two S. vulgaris ecotypes originating from copper-contrasting soil types - copper tolerant Lubietová and copper sensitive Stránská skála. In the first part of this study, we characterized a role of two candidate genes (metallothionein 3 and Heavy Metal ATPase 7) which participate in copper homeostasis. Based on a S. vulgaris BAC library screening we have identified and sequenced BAC clones containing SvMT3 and SvHMA7. We characterized their genomic structure and identified specific domains in predicted protein sequences. We found that SvMT3 gene has been locally duplicated in a tandem arrangement. Expression analysis and complementation studies using yeast mutants showed that both copies of the SvMT3 gene were functional. Moreover, we examined the expression of MT3 gene(s) in selected ecotypes under different copper treatments to show the tissue-specific expression response to copper stress. Our analysis shows that MT3a has similar expression pattern in cupricolous ecotypes while MT3b has common expression features shared by all metallophyte S. vulgaris ecotypes. Our data indicate that down-regulation of MT3b root expression in higher copper concentrations is associated with copper stress. We propose that there might be a specific regulation of SvMT3s transcription depending on the type of heavy metal tolerance. We identified the HMA7 gene with all the structural properties specific for plant copper transporting ATPases. In addition, we verified the function of SvHMA7 using heterologous complementation in yeast mutants. Analyses of SvHMA7 transcription patterns showed that both studied ecotypes upregulated SvHMA7 transcription after the copper treatment; nevertheless, SvHMA7 probably does not belong to the group of genes contributing to metal tolerance. Our data are supported by analysis of appropriate reference genes based on RNA-Seq databases. To identify genes specifically involved in copper response in the studied ecotypes, we analysed transcription profiles of genes coding Cu-transporting proteins and genes involved in the prevention of copper-induced oxidative stress in both ecotypes. Our data show that three genes (APx, POD, and COPT5) differ in their transcription pattern between the ecotypes with constitutively increased transcription in Lubietova. Taken together, we have identified transcription differences between metallifferous and non-metalliferous ecotypes of S. vulgaris. Using RNA-Seq database, we have suggested candidate genes participating in metal tolerance in this species.

Klíčová slova

měď, tolerance k mědi, Heavy Metal ATPáza 7, Metalothionein 3, Silene vulgaris, RNA-Seq databáze, qRT-PCR, referenční geny, zobecněný lineární mode, kvazi-Poisson, transportéry mědi, reaktivní formy kyslíku, eliminace volných radikálů

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2014

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 27. 6. 2014
• Vedoucí: RNDr. Roman Hobza, Ph.D.
• Oponent: doc. Mgr. Martin Lysák, Ph.D., Mgr. Jan Vrána, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biologie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie