Využití čipových technologií pro diagnostiku a terapii nádorových onemocnění

Mgr. Kateřina Staňo Kozubík, Ph.D.

Doctoral thesis

Application of microarray technology in diagnostics and therapy of lymphoproliferative disorders

Abstract:

Na vzniku a progresi nádorového onemocnění se podílí akumulace genetických změn v buňce. Tyto změny mohou mít vliv na míru exprese genů, které se nachází v postižených oblastech. Některé z těchto změn jsou specifické pro určité typy nádorů. Znalost těchto změn je důležitá pro určení prognózy i případný výběr terapeutického plánu. Současné molekulárně biologické a cytogenetické postupy umožňující detekci jedné nebo několika změn současně, jsou proto postupně nahrazovány novými technologiemi – např. DNA čipy. Komparativní genomová hybridizace na platformě čipů (aCGH) umožňuje detekci chromozomových aberací celého genomu v jediné hybridizační reakci. DNA čipy pro studium genové exprese cílené na konkrétní onemocnění mohou upřesnit nejen diagnózu, ale i prognózu onemocnění a pomoci odhalit regulační dráhy vedoucí k maligní transformaci buňky. Cílem předkládané dizertační práce je zavést tuto progresivní metodiku v Centru molekulární biologie a genové terapie Interní hematoonkologické kliniky FN Brno. DNA čipy jsme využili ke studiu nebalancovaných chromozomových aberací u chronické lymfocytární leukémie (CLL), ke sledování exprese genů non-hodgkinských lymfomů (NHL) a pro následnou stratifikaci pacientů s NHL, zejména s folikulárním lymfomem. CGH čipy byly aplikovány pro analýzu změn genomu buněk chronické lymfocytární leukémie (Human HD-CGH Microarray 4x44K, Agilent). Změny genetické informace ve srovnání s referenční sekvencí jsme nalezli u všech pacientů s CLL. Následně jsme u části CLL pacientů srovnávali výsledky fluorescenční in-situ hybridizace (FISH) s aCGH. Pomocí CGH čipů jsme nalezli množství nových, cíleným vyšetřením nezjištěných, změn genomu. Nakonec jsme sledovali souvislost mezi počtem genetických alterací a přítomností vybraných prognostických faktorů CLL. Metodu profilování genové exprese jsme využili především pro zlepšení klasifikace lymfomů. Vytvořili jsme vlastní design expresního DNA čipu určeného pro odlišení folikulárního lymfomu od jiných maligních lymfomů a pro jeho molekulární a klinickou subklasifikaci. Podařilo se nám identifikovat rozdíly v genové expresi mezi jednotlivými typy lymfomů. Výsledky ukazují na velký potenciál této metody při stanovení diagnózy a upřesnění prognózy lymfomů. Čipové technologie mají v lékařské diagnostice nadějnou budoucnost. Umožňují velmi efektivní vyšetření celého genomu a transkriptomu z jediného vzorku DNA nebo RNA. Otevírají tak cestu k účinné a časné diagnostice, prognostice a následné léčbě rakoviny.

Abstract:

Accumulation of cell genetic alterations seams to cause oncological disorders and disease progression. Genetic alterations could influence expression of genes located in involved regions. Some alterations are specific for a certain cancer. Knowledge of these alterations is important for diagnosis and contingent therapy. Current established molecular-biology and genetic practices enable detection of one or a few alterations at once. These procedures are now therefore being replaced with new technologies – e.g. DNA microarrays. Comparative genomic hybridization on the microarrays platform (aCGH) facilitates whole-genome detection of chromosomal aberrations in one reaction. Focused DNA microarrays for gene expression analysis could clarify not only diagnosis but disease prognosis as well, thus enlightening regulation pathways leading to malignant cell transformation. The aim of this thesis is to introduce DNA microarray analysis into the Center of Molecular Biology and Gene Therapy, Department of Internal Medicine – Hematology and Oncology, University Hospital Brno. DNA microarrays were used to realize three objectives: 1. Detection of unbalanced chromosomal aberrations in chronic lymphocytic leukemia (CLL), 2. Gene expression analysis in Non-Hodgkin lymphomas (NHL), and 3. Stratification of NHL patients, primarily those with follicular lymphoma. CGH microarrays were used for detection of genomic alterations in CLL cells (Human HD-CGH Microarray 4x44K, Agilent). Alterations of genomic information compared to referenced sequences were detected in 100 % of CLL pacients. Consequently, we compared results of fluorescence in situ hybridization (FISH) and aCGH in selected CLL patients. aCGH detected new genomic alterations that were not previously found with practised focused methods. In the end, we searched for the connection between the amount of genetic alterations and selected CLL prognostic factors. We employed gene expression profiling for lymphomas subclassification. We created a design of focused DNA microarray with the aim of distinquishing follicular lymphoma from other malignant lymphomas and for lymphoma molecular and clinical subclassification. We successfully identified different gene expression profiles in different lymphomas. Our results present a potential for aCGH in lymphoma diagnosis and prognosis determination. DNA microarrays have the potential to enhance methodology in and with medical diagnostics and enable effective examinations of whole genome and transcriptome from a single DNA or RNA sample. DNA microarrays will surely open a new path to effective and early cancer diagnostics, prognosis, and therapy.

Keywords

DNA čipy, maligní lymfoproliferace, aCGH, genová exprese DNA microarrays, malignant lymphoproliferations, gene expression

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 3. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 31. 3. 2011
• Supervisor: prof. RNDr. Šárka Pospíšilová, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Medicine

Doctoral programme / field:
Oncology (4-years) / Oncology