Příprava rostlinných fosfoproteinů pro LC-MS/MS analýzu

Bc. Jakub Kačenga

Master's thesis

Preparation of plant phosphoproteins for LC-MS/MS analysis

Abstract:

Tato diplomová práce se zabývá studiem fosfoproteinů v rostlinném vzorku Arabidopsis thaliana. Cílem práce je optimalizace podmínek pro identifikaci co nejvyššího počtu fosfopeptidů pomocí LC-MS/MS analýzy. Klíčovou roli při identifikaci fosfopeptidů hraje obohacení fosfopeptidů. V současné době je známo několik různých typů obohacení, nicméně v této práci je využito metody TiO2-MOAC. V práci jsou srovnány postupy obohacení prováděné na kolonkách s obohacením na destičce. V práci byl stanoven optimální poměr TiO2 : peptidy pro obohacení fosfopeptidů: v případě použití kolonek 5 : 1 a pro obohacení na destičce 2,5 : 1. Byly také srovnány dvě různé koncentrace kyseliny glykolové (0,3 M × 1 M), avšak rozdíl mezi identifikovanými fosfopeptidy byl pouze nepatrný. Dále bylo potvrzeno, že odsolení rostlinných peptidů je velmi důležitým krokem a zajišťuje lepší výsledky při detekci fosfopeptidů.

Abstract:

The diploma thesis deal with the study of a phosphoproteins in an organism of Arabidopsis thaliana. The main aim of the thesis is the optimalization of conditions of sample preparation protocol prior LC-MS/MS analysis to identify maximum number of phosphopeptides. The phosphopeptide enrichment plays a key role in the process of phosphopeptide identification. Phosphopeptide enrichment enables removal of non phosphorylated peptides which complicate or even disable phosphopeptide identification. Today, there are several types of phosphopeptide enrichment currently known, however TiO2-MOAC method is the one employed in the thesis. On-plate and column phosphopeptide enrichment protocols are compared in the thesis. Optimal ratio of TiO2 : peptides for phosphopeptide enrichment was determined: the column phosphopeptide enrichment – 5 : 1 and the on-plate phosphopeptide enrichment – 2,5 : 1. Two different concentrations of glycolic acid were also compared (0,3 M × 1 M) but the difference between number of identified phosphopeptides was slight. It has been also confirmed that desalting of peptides prior enrichment step is very important and can ensure better results for detection of phosphopeptides.

Keywords

proteomika, fosforylace, fosfopeptidy, obohacení fosfopeptidů, úspěšnost obohacení, hmotnostní spektrometrie, proteomics, phosphorylation, phosphopeptides, phosphopeptide enrichment, enrichment efficiency, mass spectrometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2017
• Supervisor: doc. RNDr. Zbyněk Zdráhal, Dr.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry