Zpracovávání, vyhodnocení a interpretace genomických dat získaných masivním paralelním sekvenováním pro klinickou praxi

Mgr. Petr VRTĚL

Doctoral thesis

Pocessing, Annotation and Interpretation of Genomic Data By Massnely Parallel Sequencing for Clinical Practice

Abstract:

Sekvenační techniky druhé generace významně zvyšují testovací kapacitu a stávají se podstatnou součástí celého odvětví klinické genetiky. Díky možnosti současného vyšetření více pacientů na více cílů, umožňují nahrazení dříve užívaných molekulárně diagnostických metod, kterým byla zejména Sangerova sekvenace. Práce popisuje zavedení a zhodnocení optimálního diagnostického přístupu založeného na vysokokapacitním sekvenování v diagnostice vzácných trombofilních stavů - deficitu proteinu S (PS), proteinu C (PC) a antitrombinu (AT). Jedná se pravděpodobně o první aplikaci metodiky vysokokapacitní sekvenace u genetického testování deficitu těchto přirozených antikoagulantů v České republice. Pro přípravu amplikonových knihoven a cílené sekvenování byla využita platforma Ion Torrent. Na základě definovaných indikačních kritérií byla selektována kohorta 31 pacientů. Pro deficit PS (7), PC (13) a AT (11). V rámci těchto skupin pacientů byla zaznamenána míra detekce mutací 67,7 %, nejvyšší ve skupině pacientů indikovaných pro deficit AT - 76,9 %. Bylo také odhaleno šest dosud nepopsaných poškozujících variant - PROS1 c.1468delA (p.Ile490fs) a c.1931T>A (p.Ile644Asn); PROC c.450C>A (p.Tyr150Ter); c.715G>C (p.Gly239Arg) a c.866C>G (p.Pro289Arg); SERPINC1 c.398A>T (p.Gln133Leu). Bylo také provedeno porovnání variant ze tří různých softwarů - Torrent Suite, Ion Reporter a NextGene u 10 kontrol. Pro data generovaná z platformy Ion Torrent se zdají být vhodnější software od stejného poskytovatele především z důvodu kvalitního odfiltrování falešně pozitivních variant. Pozorovaný záchyt poškozujících variant je v souladu se závěry publikovaných studií, které vycházely zejména z časově náročného Sangerova sekvenování. Popisovaný diagnostický postup je tedy vhodný do klinické praxe. Jeho výhodou je také zvýšení testovací kapacity u této pravděpodobně poddiagnostikované skupiny pacientů. Popsaná metodika je navíc vhodná pro využití u dalších oligogenních panelů.

Abstract:

Second-generation sequencing techniques significantly increase testing capacity within clinical settings and become an essential part of the entire field of clinical genetics. With the ability to test multiple patients on multiple targets simultaneously, they allow the replacement of previously used molecular diagnostic methods, which was primarily Sanger sequencing. This paper describes the introduction and evaluation of an optimal diagnostic approach based on high-throughput sequencing in the diagnosis of rare thrombophilic conditions - deficiency of protein S (PS), protein C (PC) and antithrombin (AT). This is probably the first application of high-throughput sequencing methodology in genetic testing for deficiency of these natural anticoagulants in the Czech Republic. The Ion Torrent platform was used for the preparation of amplicon libraries and target sequencing. A cohort of 31 patients was selected based on defined indication criteria. For PS deficiency (7), for PC deficiency (13) and for AT (11). Within these patient groups, a mutation detection rate of 67.7% was observed, with the highest rate in the group of patients indicated for AT deficiency - 76.9%. Six previously undescribed damaging variants were also detected - PROS1 c.1468delA (p.Ile490fs) and c.1931T>A (p.Ile644Asn); PROC c.450C>A (p.Tyr150Ter); c.715G>C (p.Gly239Arg) and c.866C>G (p.Pro289Arg); SERPINC1 c.398A>T (p.Gln133Leu). Variants from three different software, Torrent Suite, Ion Reporter and NextGene, were also compared for 10 controls. For data generated from the Ion Torrent platform, software from the same provider seems to be more suitable, mainly because of the high quality filtering of false positive variants. The observed detection of deleterious variants is in accordance with the conclusions of published studies, which were mainly based on time-consuming Sanger sequencing. The described diagnostic procedure is therefore suitable for clinical practice. It also allows to increase the testing capacity in this probably underdiagnosed group of patients. The described methodology is also suitable for use in other oligogenic panels.

Keywords

sekvenování DNA, vysokokapacitní sekvenování, deficit proteinu S, deficit proteinu C, deficit antitrombinu, míra detekce mutací

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 1. 2023

Thesis defence

• Supervisor: doc. Mgr. Radek Vodička, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Medicine and Dentistry

Doctoral programme / field:
Medical Genetics / Medical Genetics