Alergeny ve slupce jablek kódované genovou rodinou Mal d 1 a vliv "house keeping" genů na stanovení jejich relativní exprese

Lucie Lamačová

Bachelor's thesis

Allergens in the apple peel encoded by the Mal d 1 gene family and the effect of house keeping genes on determining their relative expression

Abstract:

Potravinovou alergií trpí celosvětově až 10 % populace a její prevalence v posledních dekádách vzrůstá. Tento trend stále nebyl uspokojivě vysvětlen, ale studie naznačují, že se jedná se o komplexní souhru v zásadě nezměněných genetických predispozic a naopak velmi proměnlivých environmentálních faktorů působících na imunitní systém jedince ale také na samotné alergeny. Primární odpovědí imunitního systému na neškodné antigeny je navození orální tolerance. V případě alergie dochází k jejímu prolomení a indukci Th2 odpovědi určené proti mnohobuněčným parazitům a produkci IgE protilátek. Tyto mechanismy a způsoby, jakým je možné navodit toleranci de novo, jsou předmětem intenzivního výzkumu.Typickým alergenem je protein, který jako každý jiný genový produkt tohoto druhu plní ve zdrojovém organismu určitou funkci, k níž je předurčen svou konformací a která spočívá především ve vazbě různých ligandů. Při porušení orální tolerance je téměř jisté, že široký repertoár protilátek najde na jeho povrchu odpovídající epitop.Alergie na jablko postihuje pouze 2 % potravinových alergiků, ale v oblasti s výskytem březového pylu (severní, západní a střední Evropa) hraje významnou roli, neboť jí trpí velké procento všech alergiků na břízu. To je důsledkem zkřížené reaktivity mezi strukturními homology Bet v 1 a Mal d 1, nejvýznamnějším alergenem jablka ze skupiny PR-10 proteinů. Jeho exprese je indukována biotickými a abiotickými stresy. Je patrný vliv ročníku i způsobu kultivace, nicméně určité hranice jsou nastaveny genotypem. Mezi nejvíce exprimované izoformy patří Mal d 1.01 a 1.02. Exprese jednotlivých izoforem vykazuje odrůdovou specifitu. Šlechtění hypoalergenních odrůd musí předcházet důkladné poznání těchto alergenů. Po stanovení základních parametrů proteinu nastává obvykle fáze porovnávání alergenicity mezi jednotlivými kultivary. Výzkumníci si kladou otázky, jestli se odrůdy navzájem liší v expresním profilu, v celkovém množství proteinu, v zastoupení či vůbec přítomnosti jednotlivých izoforem, ve vazbě IgE protilátek či ve schopnosti vyvolat reakci při orální provokaci.Jednou z běžně používaných metod měření genové exprese je kvantitativní PCR. Metoda je spojením reverzní transkripce, klasické PCR reakce a detekce na bázi značených sond. Metoda spočívá v kvantitativním měření narůstající intenzity fluorescence, zapříčiněné zdvojnásobením množství produktu v každém cyklu, jež je zobrazována v grafu v reálném čase. Principem relativní kvantifikace je normalizace hodnot k referenčnímu genu, a proto musí tento gen vykazovat stabilní expresi napříč zkoumanými vzorky.V experimentální části této práce byla provedena validace tří referečních genů (ACT7, UBC, GAPDH). K těmto genům byla normalizována exprese izoforem Mal d 1.01 a 1.02 a následně vyhodnocovány diference mezi dvěma biologickými replikáty. Kruskal-Wallisův test prokázal statisticky významné rozdíly mezi ACT7 a GAPDH. Z výsledků vyplývá, že GAPDH není jako referenční gen pro jablečnou slupku vyhovující.

Abstract:

Up to 10 % of the world's population suffer from food allergies and their prevalence has been increasing in recent decades. The cause of this increase has still not been sufficiently explained. However, the studies suggest that the individual's immune system is affected by a complex interplay between the essentially unchanged genetic predispositions and highly variable environmental factors, which are also affecting the allergens themselves. The primary immune response to harmless antigens is oral tolerance induction. In the case of allergy, this tolerance is broken and pathogen-like response is established by Th2 cells induction and IgE antibody release. These mechanisms and processes of de novo tolerance induction are subjects of intensive research.In the vast majority of cases, allergen has a protein nature. Like any other gene products it has a characteristic 3D structure determining its physicochemical properties and functional role in organism, especially in ligand binding.When the oral tolerance is disrupted, it is almost certain that a wide repertoire of antibodies will find a corresponding binding site on its surface.Globally, there is only 2 % of food allergy patients suffering from the apple allergy. However, it is relatively common among birch pollen sensitised patients in the birch pollen area (North, Western and Central Europe). The reason is the cross reactivity of the structural homologues Bet v 1 and Mal d 1, the main apple allergen from the PR-10 protein group. Mal d 1 expression is induced by the biotic and abiotic stresses. Harvesting year and cultivation method have apparent influence on the expression. However, the genotype seems to play the main role, because the expression rate of isoallergens and isoforms is cultivar dependent. The most expressed isoforms are Mal d 1.01 and 1.02. Hypoallergenic cultivars breeding is highly dependent on the knowledge about the allergens. Protein characterisation itself is followed by the comparison amongst cultivars in terms of allergenicity, whole protein or particular isoform quantification, IgE sera binding or allergic response inductibility by oral provocation.RT-PCR is the most common and widely used method for gene expression studies, consisting of three consecutive steps: reverse transcription, PCR and labeled probes detection. It is based on quantitative measurement of increasing fluorescence intensity triggered by doubling the amount of the product in each cycle, which allows real-time visualisation by an amplification plot. The relative quantification principle is the normalization of the acquired values of the gene of interest to the reference gene values. Therefore, the reference gene must show a stable expression across all samples measured.In the experimental part of this work, the validation of the three reference genes (ACT7, GAPDH, UBC) was performed. Expression of Mal d 1.01 and 1.02 isoforms has been normalised to these genes and then differences between two biological replicates has been evaluated. The Kruskal-Wallis test showed statistically significant differences between ACT7 and GAPDH. The GAPDH appeared to be not suitable to be used as a reference gene for the apple peel.

Keywords

jabloň, Mal d 1, qRT-PCR, Malus × domestica, izoalergeny, house keeping geny

Keywords

Malus × domestica, qRT-PCR, apple, isoallergens, gene expression, Mal d 1

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 17. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Crop Production