Analýza vývoje klíčních transgenních rostlin Arabidopsis thaliana nadprodukující cytokinin-glukosid specifické beta-glukosidasy Zm-p60.1

Bc. Dominik Chmelík

Master's thesis

Analysis of the development of transgenic Arabidopsis thaliana seedlings overproducing the cytokinin-glucoside specific beta-glucosidase Zm-p60.1

Abstract:

Abstrakt V rámci diplomové práce jsem analyzoval transgenní rostliny N. tabacum L. s pozměněným metabolismem cytokininů, který byl způsoben expresí kukuřičné cytokinin specifické β-glukosidasy Zm-p60.1 s finálním úložištěm v apoplastu. Nativní forma enzymu se nachází v plastidech Zea mays. Jeho funkcí je hydrolýza cytokininových O-glykosidů na aktivní formy cytokinů, což hraje významnou roli při udržování homeostázy cytokininů. Tento enzym byl zvolen jako vhodný molekulární nástroj pro detekci změn v zeatinovém metabolismu z důvodu jeho dobré charakterizace. Rostliny byly pěstovány in vitro za podmínek krátkého dne na dvou typech médií, na klasickém MS médiu a na MS médiu s přídavkem 2, 5 µM exogenního t-zeatinu . V průběhu kultivace (14, 21, 28 a 32 dní po vysetí) byl získaný rostlinný materiál podroben histochemickým, histologickým, gravimetrickým a biochemickým analýzám. Při kultivaci na MS médiu nevykazovaly transgenní varianty rostlin žádné morfologické rozdíly oproti kontrole, byla však pozorována schopnost zvýšené akumulace vody. Při kultivaci na médiu s exogenním zeatinem docházelo na bázi hypokotylu k tvorbě ektopických výrůstků, jejich tvorba byla výraznější a rychlejší u variant transgenních rostlin. Při kultivaci na médiu s exogenním cytokininem nebyly žádné rozdíly v čerstvé hmotnosti mezi kontrolní a transgenní variantou pozorovány. Histochemická indigogenní detekce β-glukosidasy prokázala při kultivaci na MS mediu její aktivitu v diferencované časti kořene v blízkosti centrálního válce. U rostlin kultivovaných na médiu s exogenním zeatinem byla aktivita Zm-p60.1 prokázána v děložních listech, v pravých listech a na bázi hypokotylu v oblasti formování ektopických struktur. Metodou imunolokalizace byla přítomnost Zm-p60.1 potvrzena v buněčných stěnách diferencovaných buněk v oblasti prokambia a na bázi hypokotylu v oblasti formování ektopických struktur. Součástí této práce bylo také hledání ortologů N. tabacum k regulátorům odpovědi u Arabidopsis. Tyto molekuly hrají významnou roli v cytokininové signalizaci. Pro vyhledávání byly použity EST databáze (N. tabacum L. taxid 4097) a aminokyselinová sekvence příjímačové domény jako předloha pro vyhledávání. Na základě vyhledávání byly nalezeni celkem tři vhodní kandidáti, experimentální ověření jejich přítomnosti u rostlin tabáku bude provedeno v navazující práci.

Abstract:

In this diploma thesis I analyzed transgenic N. tabacum L. plants overproducing cytokinin specific maize β-glucosidase Zm-p60.1 localized to the apoplast. The native enzyme is localized in plastids of Zea mays. It converts cytokinin O-glucosides to its active form, this conversion is important step in maintaining cytokinin homeostasis. Zm-p60.1 was chosen as a suitable molecular tool for characterizing changes in zeatin metabolism. Plants were cultivated in vitro under short day conditions. We chose two types of medium, standard MS and MS supplemented with 2,5 µM t-zeatin. Plants were collected 14, 21, 28 and 28 days after sowing. Histochemical, histological, gravimetric and biochemical analyses were performed. There were no obvious morphological changes in transgenic plants on MS medium, but plants showed an increased ability to accumulate water. Transgenic plants formed ectopic structures at the base of the hypocotyl when cultivated on medium supplemented with zeatin. Their structured was more developed than the control variant. There were no changes in fresh weight between transgenic and control plants cultivated on medium with exogenous zeatin. Histochemical indigogenic detection of activity Zm-p60.1 shows its activity in differentiated parts of the root near the central stele on MS medium. The activity of Zm-p60.1 was detected in cotyledons, leaves and at the base of the hypocotyl on Z medium. Imunolocalization showed the presence of Zm-p60.1 in cell walls of differentiated cells in the region of procambium and at the base of the hypocotyl in the region where ectopic structures were formed. Database searches were conducted to look for N. tabacum orthologs to type-A Arabidopsis response regulators, the effector molecules in cytokinin signal transduction. We used EST databases (N.tabacum L. taxid 4097) and the receiver domain amino acid sequence as a query. Three suitable candidates were found and primers designed. Molecular analyses of these putative tobacco response regulators will form part of the ongoing work in the near future.

Keywords

Cytokinin, t-Zeatin, O-glukosid, regulátor odpovědi, Zm-p60.1, beta-glukosidasa

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 23. 5. 2011

Thesis defence

• Date of defence: 24. 6. 2011
• Supervisor: RNDr. Jaroslava Dubová, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / General Biology