Targeted Biomolecules Analysis using Capillary Electromigration Metod

Mgr. Marta Zeisbergerová, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Bioanalýza a výzkum v oblasti věd o životě vyžaduje spolehlivé analytické separační metody. Mezi nadějné bioanalytické techniky patří kapilární elektromigrační metody odvozené od kapilární elektroforézy (CE), které umožňují analýzu komplexních vzorků, jakými jsou např. vzorky biologického, klinického a environmentálního původu. Kapilární rozměry umožňují velmi účinnou analýzu malých množství vzorku. Avšak i práce s velkými objemy vzorků při využití některé prekoncentrační techniky je v bioanalýze velice přínosná. Animokyseliny, peptidy a proteiny mohou být v oblasti analýzy biomolekul jak předmětem studia, tak mohou sloužit i jako nástroj pro stanovení jiných biologicky významných látek. Pro realizaci výše uvedených komplexních studií separační techniky vyžadují účelnou a automatizovanou instrumentaci, pokroky v metodologii, inovační přístupy, robustní separační prostředí a citlivé detekční techniky. První část disertační práce je tedy zaměřena na pokroky v instrumentaci a metodologii kapilární elektrochromatografie (CEC). Specializovaná instrumentace vhodná pro kapilární separační metody zajišťuje manipulaci s malým množstvím vzorku, precizní zacházení s kapalinami a přesnou kontrolu samotné separace. Metodologie a optimalizace dávkovacího procesu v CEC je doložena vysokou opakovatelností všech kroků a CEC separacemi v isokratickém, prekoncentračním a gradientovém modu. Navazující část je věnována využití CEC metody kombinované s UV detekcí pro kontrolu vzorků vody na přítomnost microcystinů, cyklických peptidových hapatotoxinů, a prověření jejich struktury. Extrakty z cyanobakterií obsahujících malé množství microcystinů jsou analyzovány díky prekoncentraci vzorku na separační koloně. Následující část uvádí přehled dědičných onemocnění souvisejících s metabolismem aminokyselin. Fenylalanin a homocystein byly zvoleny jako markery typických aminoacidopatií. Pro jejich stanovení je užita CE metoda s citlivou laserem indukovanou fluorescencí v miniaturizované konfiguraci. Poslední kapitola popisuje aplikaci CE techniky známé jako elektroforeticky zprostředkovaná mikroanalýza (EMMA) v proteomice. Koncepce částečného plnění kapiláry, začleněná do příslušné metody, umožňuje použití pufru optimálního pro proteolytické štěpení v případě kdy větší část kapiláry je naplněna základním elektrolytem vhodným pro separaci digestu příslušného proteinu. Výsledkem separace jsou peptidové mapy tří testovaných proteinů.

Abstract:

Bioanalysis and life sciences research require reliable analytical separation methods. Capillary electromigration methods derived from capillary electrophoresis (CE) have been presented as promising bioanalytical techniques in challenging analyses of complex samples like biological, clinical and environmental specimens. The capillary format enables to perform analyses of small sample amounts in a very efficient way. On the other hand, the easy handling of large sample amounts using some preconcentration processes is also contributive point in bioanalysis. In biomolecules analysis, amino acids, peptides and proteins can be traced in accessible samples or they can even serve as a research tool to determine other biologically significant compounds. For realization of the above mentioned comprehensive studies, the separation techniques still call for dedicated automated instrumentation, methodological improvements, innovative approaches, robust separation environment and sensitive detection techniques. Therefore, the first part of the thesis is focused on the equipment settings in capillary electrochromatography (CEC). Specialized instrumentation suitable for capillary separation methods ensures manipulation of small sample volumes, precise liquid handling and accurate controlling of the separation itself. The methodology and optimization of injection process in CEC are documented by high repeatability of all operations and illustrated on the separations in isocratic, preconcentration and gradient modes. In the subsequent part the CEC method combined with UV detection is applied to water samples to examine the presence of microcystins, cyclic peptide hepatotoxins, and their structure. Moreover, low concentrated cyanobacterial extracts are examined thanks to on-column sample preconcentration. Next part gives an overview of hereditary disorders in amino acid metabolism. Two amino acids, phenylalanine and homocysteine, are chosen as characteristic markers of aminoacidopathies. The CE method with sensitive laser induced fluorescence detection of miniaturized configuration is utilized for amino acid determination in blood. Finally, the CE technique known as electrophoretically mediated microanalysis (EMMA) is integrated in proteomic studies. The concept of partially filled capillary, incorporated in the method, enables the presence of buffer suitable for proteolysis when the rest of capillary is filled with the background electrolyte optimal for the separation of tryptic digest. The developed method results in the excellent separation of digests of three test proteins.

Keywords

Capillary electromigration methods, CEC methodology, amino acids, peptides, proteomics.

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 6. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 1. 7. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.
• Reader: prof. RNDr. Juraj Ševčík, Ph.D., doc. Ing. Ivan Mikšík, DrSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Biochemistry (4-years) / Biochemistry