Produkce specifických antibakteriálních agens u druhů rodu Yersinia

Bc. Petra Kotrsalová

Diplomová práce

Production of specific antibacterial agents in the genus Yersinia

Anotace:

Křížovým testem jsme vyšetřili 53 kmenů rodu Yersinia na produkci specifických antibakteriálních agens (bakteriofágů, bakteriocinů, mikrocinů), každý kmen byl vyšetřen jako potenciální producent i jako potenciální indikátor. K dispozici jsme měli 6 druhů Yersinia spp. (Y. aldovae, Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. rohdei. Y. ruckeri), které jsou obecně považovány za nepatogenní a vyskytují se v prostředí. Identifikovali jsme 6 kmenů (11 %) produkujících bakteriociny (jeden z Y. frederiksenii, jeden z Y. intermedia, čtyři z Y. ruckeri) a 2 kmeny produkující bakteriofágy (4 %, oba z Y. kristensenii). Bakteriociny byly charakterizovány několika metodami. Inhibiční zóny okolo produkčních kmenů byly jasné a šířky mezikruží zón se pohybovaly od 3 do 4 mm, což je typické pro inhibiční zóny vytvořené koliciny. Titr bakteriocinu po dezintegraci produkčních buněk byl v rozmezí 100 až 101 AU (arbitrárních jednotek). Spektrum aktivity antibakteriálních látek bylo testováno na kmenech 8 druhů čeledi Enterobacteriaceae (25 kmenů), přičemž žádný užitý indikátorový kmen nebyl vůči produkovaným agens citlivý. Vyšetřením restrikčního profilu jsme zjistili, že plazmidová DNA izolována ze čtyř produkčních kmenů je vzájemně podobná (čtyři kmeny Y. ruckeri), u jednoho se odlišuje (Y. frederiksenii) a u jednoho kmene se nepodařilo restrikční profil stanovit (Y. intermedia). Pro identifikaci bakteriocinů pomocí PCR jsme navrhli specifické primery známých kolicinových a mikrocinových genů. V žádném případě nebyl detekován pozitivní PCR produkt. Prokázané bakteriociny mohou tedy představovat nový typ bakteriocinu. Plazmidová DNA kmene Y. frederiksenii byla po inzerci transpozonu Tn7 transformována do elektrokompetentních buněk E. coli DH10alfa. Rekombinantní plazmidová DNA byla sekvenována a byly nalezeny sekvence příbuzné ke Col-plazmidům i sekvence zatím nepopsané. Bakteriofágy (Y. kristensenii) byly charakterizovány morfologií plaků, spektrem aktivity, inducibilitou mitomycinem C a elektronovou mikroskopií. Fágy měly velmi úzké spektrum aktivity, citlivým indikátorem z testovaných byl jediný kmen Y. kristensenii a byl společný pro oba fágy. Fágy se však lišily morfologií vytvářených plaků (plaky matné) a jsou tedy pravděpodobně odlišné. Ani jeden z fágů nebyl inducibilní mitomycinem C. Elektronovou mikroskopií byly pozorovány fágy s ikozahedrickou hlavičkou a kontraktilním bičíkem, což odpovídá morfologickému typu A1 a patří do čeledi Myoviridae

Abstract:

Production of specific antibacterial agents in the genus Yersinia In a cross-test, we examined 53 strains of genus Yersinia against each other as potencial producers of specific antibacterial agents (bacteriophages, bacteriocins, microcins) and as potential sensitive indicators for them. We tested 6 strains of Yersinia spp. (Y. aldovae, Y. intermedia, Y. frederiksenii, Y. kristensenii, Y. rohdei, Y. ruckeri) generally considered to be nonpathogenic and environmental. Six strains (11%) produced bacteriocins (one of Y. frederiksenii, one of Y. intermedia, four of Y. ruckeri) and two bacteriophages (4%, both of Y. kristensenii). Bacteriocins were characterized by several methods. Inhibition zones around producer strains were clear and widths of circular ring zones ranged from 3 to 4 mm, which is typical for inhibition zones of colicins. Concentrations of bacteriocins after disintegration of producer cells were only 100 and 101 AU (arbitrary units). Host range activity was specified by trstiny of 8 species of Enterobacteriaceae (25 strains). No sensitive indicator outside genus Yersinia was found. Plasmid DNA was characterized by restriction endonuclease digest. Plasmid DNA profile of four producer strains of Y. ruckeri was identical, producer strain of Y. frederiksenii had different restriction pattern and one strain of Y. intermedia was not characterized. We designed specific primers for known colicin and microcin genes and tested all producers by PCR. No positive PCR products were found suggesting that the identified bacteriocins may represent novel types. Plasmid DNA of Y. frederiksenii was subjected to Tn7 transposon insertions and was transformed into electrocompetent cells of E. coli DH10alfa. Recombinant plasmid DNA was sequenced and sequences related to Col-plasmids as well as unique sequences were found. Produced bacteriophages (Y. kristensenii) were specified by morphology of plaques, host range activity, inducibility with mitomycin C and electrony microscopy. Phages had narrow host range activity infecting only one sensitive indicator of Y. kristensenii from tested strains. The indicator strain was the same for both of them. Phages were distinct in morphology of plaques (turbid plaques) suggesting that they are different. Both were not inducible with mitomycin C. As shown by electrony microscopy, bacteriophages had icosahedric heads and contractile tails that are typical for morfological type A1 and belong to family Myoviridae.

Klíčová slova

Yersinia, Enterobacteriaceae, bakteriocin, kolicin, mikrocin, bakteriofág, inhibiční agens.

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 8. 2007

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 14. 2. 2008
• Vedoucí: prof. RNDr. Jan Šmarda, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Obecná biologie