Využití enzymů imobilizovaných na magnetických mikročásticích při studiu metabolismu léčiv

Bc. Jan Schejbal

Master's thesis

Application of enzymes immobilized on magnetic particles for the drug metabolism studies

Abstract:

V této diplomové práci se věnujeme možnostem přípravy a využití mikroreaktoru tvořeného imobilizovaným enzymem (IMER) na magnetických částicích pro studium metabolismu léčiv. Stanovení metabolických profilů je nedílnou součástí výzkumu kandidátních léčiv a farmaceutický průmysl vyvíjí enormní úsilí v oblasti vývoje metod, které umožňují rychlé a kvalitní analýzy velkého množství látek s terapeutickým potenciálem. Jednou z možností je využití IMERu ve spojení s kapilární elektroforézou v on-line uspořádání. Studie navazuje na výzkum, ve kterém byla optimalizována metoda imobilizace enzymu cytochrom P450 2C9 (CYP2C9) na magnetické mikročástice. Jako modelová reakce je použita hydroxylace diklofenaku, jejíž produkt 4‘-hydroxydiklofenak je detekován pomocí UV-VIS spektrofotometrie. Námi vyvinutá metoda přípravy IMERu vykazuje vysokou spolehlivost a opakovatelnost. Při jeho využití v kombinaci s kapilární elektroforézou v on-line uspořádání dochází k významné úspoře reagencií v porovnání s klasickými postupy a v případě zavedení metody do multikapilárních systémů je možné významným způsobem zvýšit vzorkovací kapacitu metody. Zásadním problémem, se kterým se setkáváme, je operační stabilita imobilizovaného enzymu, který rapidně ztrácí aktivitu. Cílený experiment odhalil, že nízká operační stabilita není důsledkem nastavení metody, ale vlastností imobilizovaného enzymu. Výsledky tak ukazují, že využití IMERu pro studium metabolismu je vhodnou alternativou v případě použití dostatečně stabilního imobilizovaného enzymu.

Abstract:

In this thesis we study feasibility of preparation and application of immobilized enzyme microreactor (IMER) using magnetic particles for drug metabolism studies. Determination of metabolomic profiles of candidate drugs is integral part of their development and the pharmacology industry makes enormous effort in research and development of methods capable of fast and quality analysis of vast quantities of compounds with therapeutic potential. One of the possibilities is employment of IMER in association with capillary electrophoresis using on-line configuration. This study follows in research, where a method of cytochrome P450 2C9 immobilization on magnetic microparticles was optimized. The hydroxylation of diclofenac is being used as the model reaction and the product 4’-hydroxydiclofenac is being detected using UV-VIS spectrometry. The presented method of IMER preparation shows high reliability and repeatability. The subsequent association with capillary electrophoresis in on-line configuration leads to significant reduction of reagents consumption in comparison with common procedures and prospective deployment of this method in multicapillary systems may significantly increase throughput capacity. The fundamental problem we have encountered is the operational stability of the immobilized enzyme, which loses its activity rapidly. Following measurement revealed that low operational stability is not caused by method setup but is rather a feature of immobilized enzyme itself. From the results can be concluded that using IMER for drug metabolism studies is the applicable alternative in case of deploying sufficiently stable immobilized enzyme.

Keywords

Cytochrom P450 2C9, IMER, kapilární elektroforéza, diklofenak, magnetické mikročástice, Cytochrome P450 2C9, capillary electrophoresis, diclofenac, magnetic microparticles

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2014

Thesis defence

• Date of defence: 23. 6. 2014
• Supervisor: prof. RNDr. Zdeněk Glatz, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Analytical Biochemistry