Transmembránové proteiny jako potenciální diagnostické a terapeutické cíle v onkologii

Bc. Pavlína Holešínská

Diplomová práce

Transmembrane proteins as potential diagnostical and therapeutical targets in oncology

Anotace:

Tetraspanin 1 (TSPAN1) je transmembránový protein o velikosti 26 kDa. Patří do tetraspaninové rodiny, která je charakterizována 4 transmembránovými úseky, dvěma extracelulárními smyčkami a množstvím posttranslačních modifikací. Obecnou funkcí těchto proteinů je laterálně organizovat cytoplasmatickou membránu a sloužit jako kotva pro interakční proteiny. O konkrétních funkcích a interakčních partnerech TSPAN1 není mnoho známo, jeho exprese je ovšem modifikována u různých typů nádorů, kde se také předpokládá jeho zapojení do metastatických drah. Hlavním cílem této diplomové práce bylo vyvinout myší monoklonální protilátky, které by specificky rozeznávaly TSPAN1 jak v buněčných liniích, tak v nádorové tkáni při použití imunologických metod (imunobloting, imunohistochemie). Pro splnění cíle byly nejprve připraveny expresní vektory pro extracelulární smyčku TSPAN1, která byla vybrána jako ideální pro detekci protilátkami. Vektory byly vneseny do bakteriálních systémů a byla indukována produkce rekombinantních proteinů. I přes jejich nesnadnou purifikaci, jelikož proteiny byly produkovány do inkluzních tělísek, bylo dosaženo dostatečného výtěžku k tomu, aby byla zahájena fáze imunizace myší. I přes dobrou imunitní odpověď myší detekovanou v séru a následnou úspěšnou fúzi nebyla při konečném testování získaných hybridomů zjištěna specifická reakce protilátek s TSPAN1. Kromě vývoje monoklonálních protilátek byla také snaha o lepší charakterizaci TSPAN1 a jeho detekci v různých buněčných liniích. U panelu 22 linií byla zjištěna hladina TSPAN1 na úrovni mRNA pomocí kvantitativní PCR v reálném čase a následně detekována i na úrovni proteinu pomocí imunoblotingu. Výsledky těchto dvou metod vzájemně nekorelují a důvodem jsou zřejmě bohaté posttranslační modifikace TSPAN1, které brání reakci protilátky s epitopem. Poslední část práce je věnována přípravě proteinu pro identifikaci interakčních partnerů TSPAN1 metodou „phage display“.

Abstract:

Tetraspanin 1 (TSPAN1) is 26 kDa transmembrane protein. TSPAN1 belongs to tetraspanin family which is characterized by 4 transmembrane segments, two extracelullar loops and large number of post-translational modifications. The general role of these proteins is to organize cytoplasmatic membrane laterally and serve as an anchor for interaction proteins. There is no many information about specific functions and interaction partners of TSPAN1 but it is known that its expression is modified in different types of carcinoma tissues where its involvement in metastatic pathways is expected. The main aim of this thesis was to develop mouse monoclonal antibodies which would specifically distinguish TSPAN1, both in cell lines and in carcinoma tissues, by immunological methods (immunoblotting, immunohistochemistry). At first, the extracelullar loop of TSPAN1 was chosen as an ideal targer for antibody detection and the expression vectors with TSPAN1 extracellular loop insert were prepared. The vectors were introduced into bacteria and the production of recombinant proteins was induced. The difficult purification of recombinant proteins, which were produced into inclusion bodies, gave after optimization sufficient amount of purified proteins for mice immunizations. Despite positive immune response that was detected in mice serum and succesful fusion, no specific recognition of TSPAN1 protein was detected at the final testing of obtained hybridomas. There was also an effort to better characterize TSPAN1 and its expression in 22 cell lines. We looked into the TSPAN1 both mRNA and protein levels using quantitative real time PCR and immunoblotting. The results of these two methods do not correlate. Probably the extensive post-translational modifications of TSPAN1 hinder antibody-epitope reaction and cause this discrepancy. The last part of the thesis is dedicated to preparation of protein for identification of interaction partners of TSPAN1 by phage display method.

Klíčová slova

tetraspaniny, TSPAN1, tumorové markery, monoklonální protilátky, tetraspans, tumor markers, monoclonal antibodies

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 30. 4. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 6. 6. 2012
• Vedoucí: doc. Mgr. Pavel Bouchal, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie