Effect of chromatin assembly on genome stability

Mgr. Veronika Pavlištová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Tato práce je zaměřena na problematiku stability genomu ve spojitosti se sestavováním chromatinu a také na faktory schopné tuto stabilitu narušovat. Toto téma se během posledních několika desítek let stalo velmi populárním, tudíž se mu věnuje celá řada odborných publikací, a právě nejnovější poznatky z nich vycházející jsou zde zpracovány. Hlavními nástroji pro studii tématu vlivu sestavování chromatinu na stabilitu genomu byly zvoleny telomery a klastry 45S rDNA v rostlinném modelovém systému, konkrétně Arabidopsis thaliana. Telomery jsou nukleoproteinové struktury formující konce lineárních chromozomů, které jsou tak chráněny před mylným rozpoznáním jakožto poškozenou DNA vyžadující opravu. Stejně jako telomery, 45S rDNA jednotky jsou taktéž složeny z mnoha tandemových repetic a podle organismu jich můžeme najít až stovky tisíc v jednom genomu. Ty kopie, které jsou aktivně transkribovány, se dále zpracovávají v několik výsledných druhů RNA a tvoří katalytické části ribozomů. Oba typy těchto vysoce repetitivních sekvencí jsou pro osud buňky životně důležité a s tím souvisí i fakt, že slouží jako markery pro genomovou nestabilitu. Postupný a velmi závažný úbytek v rámci genomu u mutantů pro geny komplexu zvaného Chromatin assembly factor 1 (CAF-1) mají taktéž společný. CAF-1 je evolučně konzervovaný histonový chaperon nakládající tetramery (H3-H4)2 na nově vzniklou DNA během replikace, a tím se podílející na formování chromatinové struktury vyššího řádu. Účastní se údržby a s tím souvisejících reparačních procesů celé délky DNA, a tudíž i úseků kódujících ribozomální geny a telomery. Úkolem této dizertační práce bylo nejen zpracovat příslušnou teorii, ale rovněž objasnit případnou účast homologně-rekombinační reparace při ztrátě telomer a 45S rDNA u CAF-1 mutantů experimentálně. Za tímto účelem byli fas mutanti zkřížení s rostlinami s mutací v genu pro RAD51B, a tím vytvořeni mutanti dvojití. Naše výsledky ukazují, že absence RAD51B snižuje tempo úbytku rDNA podjednotek, což potvrzuje účast tohoto proteinu v procesu ztráty ribozomálních sekvencí u fas mutantů. Překvapivě, tento efekt u telomer pozorován nebyl. Zapojení DNA opravných procesů v dynamice rDNA u CAF-1 mutantů je dále podpořeno akumulací dvouvláknových zlomů lokalizovaných ve 45S rDNA, a to především v transkripčně aktivních regionech. To napovídá, že tyto opravné procesy přispívají ke ztrátám rDNA u rostlinných fas mutantů, pravděpodobně cestou „single-stranded annealing“ (SSA) rekombinace. Během SSA rekombinace, do které je RAD51B přímo zapojen, dochází k vyštěpení poškozené repetice, obsahující dvouvláknový zlom, a tím i ke zkrácení celkové délky DNA. Dále bylo cílem zjistit, jaký je dopad obnovení původní funkce chaperonu u mutantních rostlin na stabilitu genomu při využití několika různých přístupů. Jako jeden z výstupů jsme získali rostliny s morfologií odpovídající jedincům standardního typu, stejně jako poznatky o schopnosti ztrátu telomer a rDNA zvrátit. Ukázali jsme, že mutantní fenotyp není závislý na délce telomer, ani počtu kopií rDNA jednotek. Také jsme charakterizovali rozložení rRNA genů v souvislosti s buněčným jadérkem, a současně narušení asociace rDNA na chromozomu 4 s jadérkem u revertovaných linií. A co více, různé úrovně znovuzískaných rRNA genů se projevily odlišným zastoupením jejich jednotlivých variant v rámci genomové DNA. Následně došlo k epigenetickému přeprogramování expresních profilů u genů pro rDNA během jejich zpětné akumulace, a také k reorganizaci jednotlivých lokusů mezi chromozomy 2 a 4. Závěrem byl na základě zjištěných dat navržen model pro úbytek a expanzi telomerových a rDNA re

Anotace:

petic.

Abstract:

This work is focused on genome stability in connection to chromatin assembly process. This topic became very popular during the last few decades, many papers were published and the overview is summarized in this thesis. As a subjects of the study telomeres and clusters of 45S rDNA were chosen in the plant model system of Arabidopsis thaliana. Telomeres are nucleoprotein structures forming the termini of linear eukaryotic chromosomes, protecting them from being misrecognized as targets for the DNA damage repair machinery. As well as telomeric DNA, 45S rDNA units are also tandemly repeated DNA sequences and different organisms can possess hundreds or thousands of copies. Those units, which are actively transcribed, are processed into several kinds of RNAs and form catalytic parts of ribosomes. Both types of this highly repetitive sequences are vitally important for the fate of the cell. Correspondingly, they play role as genome instability marker and both were identified to be severely decreased in their number in mutants in Chromatin assembly factor 1 (CAF-1). CAF-1 is an evolutionarily conserved histone chaperone depositing (H3-H4)2 tetramers to DNA during replication-dependent chromatin assembly. Thus, this chaperone is obviously involved in maintenance and related repair processes of ribosomal genes and telomeres. The aim of this thesis was not only to describe the theoretical background but also to clarify a role of homology-dependent repair in telomere and 45S rDNA loss in CAF-1 mutants experimentally. For this purpose, fas mutants were crossed with mutants in gene RAD51B to generate double mutants. Our results show that the absence of RAD51B decreases the rate of rDNA loss, confirming the implication of this protein. Interestingly, this effect is not observed for the telomeric repeat loss in the CAF-1 mutants. Involvement of DNA damage repair in rDNA dynamics in fas mutants is further supported by accumulation of double-stranded breaks in 45S rDNA, especially in the transcribed regions. This results suggest that the repair contributes to the rDNA repeat loss in CAF-1 mutant plants presumably via the single-stranded annealing (SSA) recombination pathway. During the SSA, in which the RAD51B protein is involved, the double-strand DNA damage site in the middle of the repetitive sequence is repaired by cutting the injured repeat out of the genome, and thus shortening the total lengths. The question about the effect of the reintroduction of the CAF-1 function back into the mutant background via several different approaches was a subject of our interest as well. We obtained plants of wild-type morphology and revealed the ability of telomeres and ribosomal genes to recover. We show that the mutant phenotype is independent of telomere lengths or rDNA copy numbers. We further characterize subnuclear partitioning of rRNA genes, and find that the typical NOR4 nucleolar association is disturbed in reverted lines. Diverse recovery levels of rRNA genes result in a strikingly different representation of their variants. Thus our results show major transcriptional reprogramming and spatial rearrangement of rDNA loci in plants with restored CAF-1 function, establishing new equilibria that are compatible with WT developmental phenotypes. In the end, a model for the contraction and expansion of this repeats due to the loss and reversion of the CAF-1 function is discussed.

Keywords

Arabidopsis thaliana, CAF-1, FAS1, FAS2, telomery, rDNA, RAD51B, reverze, sestavování chromatinu, genomová nestabilita

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 2. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 4. 2016
• Vedoucí: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.
• Oponent: RNDr. Roman Matyášek, CSc., RNDr. Jiří Široký, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Genomika a proteomika